陸學(xué)軍，張將

1.衛(wèi)生部北京醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京100730；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)系，湖南 長沙 410013

0 前言

1 材料和方法

全自動血凝儀已廣泛應(yīng)用于臨床，具有高效、準(zhǔn)確、簡便的優(yōu)點(diǎn)，為手術(shù)前檢查、血栓與止血疾病診治、預(yù)后分析提供了較可靠的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，且較大地提高了工作效率[16，22]。但在日常工作中，我們會遇到外觀異常的標(biāo)本，如溶血、脂血、黃疸標(biāo)本，這些異常會干擾檢測，對檢驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響。為此，本實(shí)驗(yàn)用干擾物對我科引進(jìn)的Beckman-Coulter ACL-TOP血凝儀抗干擾能力進(jìn)行評價。

1.1 材料

1.1.1 儀器

美國Beckman Coulter公司ACL TOP全自動血凝分析儀，Sysmex xs-800i全自動血細(xì)胞分析儀，日本奧林巴斯公司AU5400生化分析儀。

1.1.2 試劑

美國Beckman Coulter公司提供。① 凝血酶原時間測定試劑PT-FIB（批號0020003000）；部分凝血活酶時間APTT及Cacl2（批號0020006800）；③ 凝血酶時間TT（批號 0008469110）。

1.1.3 血漿

收集40名體檢健康人抗凝靜脈血各5mL，3000r/min離心10min，40份血漿等量混合后作為試驗(yàn)血漿。正常值質(zhì)控血漿（批號0020003110）和通用定標(biāo)血漿（批號0020003700）由Beckman Coulter公司原裝進(jìn)口。

1.1.4 干擾物

① 脂血：脂肪乳（主要成分為甘油三酯，華瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號：0510019），經(jīng)已校準(zhǔn)過的AU5400生化分析儀測定；② 黃疸：膽紅素標(biāo)準(zhǔn)品（上?？迫A公司生產(chǎn)，批號：GF62K），以總膽紅素含量表示，經(jīng)已校準(zhǔn)過的AU5400生化分析儀測定；③ 血紅蛋白：洗絳壓積紅細(xì)胞用蒸餾水稀釋，離心去除細(xì)胞碎片，保留血紅蛋白層，經(jīng)已校準(zhǔn)過的xs-800i血細(xì)胞分析儀測定。

1.2 方法

1.2.1 精密度試驗(yàn)

從混合好的體檢健康人試驗(yàn)血漿中取20份（每份500μL），于4h內(nèi)在ACL TOP 血凝儀上參照儀器操作SOP文件測定PT、APTT、TT、FIB[1-4]，觀察其批內(nèi)精密度；采用當(dāng)月工作日內(nèi)正常值質(zhì)控血漿質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)作日間精密度試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 準(zhǔn)確性試驗(yàn)

取l份定標(biāo)（靶值）血漿重復(fù)測定5次。取平均值即為測定值。

1.2.3 干擾性試驗(yàn)

根據(jù)美國國家臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會制定的“臨床化學(xué)干擾試驗(yàn)”指南的要求，采取在體外添加干擾物于正常血漿中的方法制備待測標(biāo)本[5-6,31]。為減少基質(zhì)效應(yīng)，3種干擾物分別用體檢健康人混合血漿配置（見表4）。終濃度分別為甘油三酯（TG）0～10.86mmol/L；總膽紅素（TBIL）0～416μmol/L；血紅蛋白（Hb）0～7.1g/L。在ACL TOP 血凝儀上測定PT、FIB、TT、APTT各2次，取平均值。記錄加入前后測定值的變化，以未加干擾物的混合血漿測定值為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算出影響度，以影響度作為評價指標(biāo)。影響度=[(加干擾物混合血漿測定值－未加干擾物混合血漿測定值)/未加干擾物混合血漿測定值]×100 %[12,33]。

1.2.4 測定方法

凝固（濁度）法測定；發(fā)色（吸光度）法測定；免疫學(xué)測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

定標(biāo)血漿與靶值比較采用單樣本t檢驗(yàn)（SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理）。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗(yàn)

測定PT、APTT、TT、FIB，結(jié)果見表l～2。(x±s)的批內(nèi)精密度CV<4.0%，日間精密度CV <4.0%。

表1 PT、APTT、TT、FIB批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(x±s)

表2 PT、APTT、TT、FIB日間精密度試驗(yàn)結(jié)果(x±s)

2.2 準(zhǔn)確性試驗(yàn)

測定標(biāo)血漿5次，測定值與靶值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，見表 3。

表3 PT、APTT、TT、FIB準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果(x±s)

2.3 干擾性試驗(yàn)

ACL TOP測定加入各類不同濃度干擾物的試驗(yàn)血漿PT、APTT、TT、FIB結(jié)果，與干擾物對照濃度（%）對比，HB、TBIL為干擾物時測得PT、APTT、TT、FIB的影響范圍在±8%之內(nèi)。TG為干擾物時測得TT、FIB的影響范圍在±6%之內(nèi)。TG在0～4.34mmol/L時，PT影響度為0～-13.5%；TG在6.52～10.86mmol/L時，PT影響度為-16.2%～-18.9%。TG在0～2.17mmol/L時，APTT影響度為0～-10.4%；TG在4.34～10.86mmol/L時，APTT影響度為-16.5%～-26.3%。詳見表4～7。

表4 各濃度干擾物混合血漿待測物配制法

表5 不同濃度血紅蛋白(Hb)對ACL TOP血凝儀測定結(jié)果的影響

表6 不同濃度總膽紅素(TBIL)對ACL TOP血凝儀測定結(jié)果的影響

表7 不同濃度甘油三酯(TG)對ACL TOP血凝儀測定結(jié)果的影響

3 討論

PT、APTT、TT和FIB是臨床凝血功能判斷的常規(guī)測定項(xiàng)目；是外科手術(shù)前凝血功能異常篩查的必查項(xiàng)目；是血栓前狀態(tài)的檢查、彌漫性血管內(nèi)凝血出血疾?。―IC）的實(shí)驗(yàn)診斷，以及對各種抗凝治療者的用藥指導(dǎo)和預(yù)后估計(jì)等的診斷項(xiàng)目，在臨床疾病診療中具有重要的價值[2,4,33]。目前市場已有多種凝血儀和試劑盒提供，使凝血功能檢測簡便、快速、實(shí)用，在臨床得到廣泛應(yīng)用。當(dāng)代最先進(jìn)的血液凝固分析儀，能同時應(yīng)用不同的實(shí)驗(yàn)原理，對大量的標(biāo)本進(jìn)行多項(xiàng)指標(biāo)的檢測；同時，儀器對標(biāo)本和試劑的需求量比手工方法用量幾乎少一半，大大地降低了檢測的成本[7-8,12]。ACL TOP 血凝分析儀是一個可隨時加入標(biāo)本進(jìn)行檢測且專為血栓實(shí)驗(yàn)室用于體外診斷而設(shè)計(jì)的平臺式全自動分析儀。它不僅具有高度自動化、快速檢測和操控界面先進(jìn)的特點(diǎn)，還可同時采用凝固法、免疫比濁法和發(fā)色底物法檢測20多個凝血相關(guān)指標(biāo)。檢測能力可達(dá)到360個PT測試/h或320個APTT測試/h或330個PT/APTT組合測試/h（165個APTT和165個PT測試）。它的高效率、大樣本分析能力，可為臨床提供凝血、抗凝、纖溶系統(tǒng)各項(xiàng)指標(biāo)的分析檢測?？捎糜诔鲅c血栓性疾病的診斷、抗凝藥劑量監(jiān)測及預(yù)后分析[1,3,9,10]。

ACL TOP血凝儀使用于正常外觀血漿標(biāo)本，測定PT、APTT、TT和FIB時變異系數(shù)都<4%，效果較理想。但在實(shí)際工作中會經(jīng)常涉及到異常外觀血漿標(biāo)本，如血漿中深淺不一的溶血和黃疸色澤、食糜含脂類或蛋白引起的混濁等干擾物質(zhì)的物理性質(zhì)影響血凝儀對血液凝固終點(diǎn)的判別，對測定方法起干擾效應(yīng)[13-14]。為此，本人做了干擾性試驗(yàn)，采用日本臨床化學(xué)學(xué)會的日本工業(yè)規(guī)格（Japanse industrialstandard，JIS）制定的“干擾物質(zhì)的影響測試法”，并借鑒國際臨床化學(xué)委員會（IFCC）的“臨床化學(xué)中藥劑的影響”的方法和美國國立臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會（National Committee for Clinical Lab—Oratory Standard，NCCLS）制定的“臨床化學(xué)中干擾性測試指南”的檢測方法。試驗(yàn)采取體外干擾物質(zhì)影響試驗(yàn)—添加試驗(yàn)法。添加干擾物的最高濃度包括引起干擾影響物質(zhì)的最高濃度。我們選用干擾物最終濃度為：Hb7.1g/L；TG10.86mmol/L；TBIL416μmol/L。為了在添加干擾物后使原試驗(yàn)血漿的基質(zhì)變化保持在最小限度，最好使添加干擾物的量與原試驗(yàn)血漿相比保持在最低。IFCC認(rèn)為，添加干擾物溶液量：原實(shí)驗(yàn)血漿量為1:9 ；NCCLS則認(rèn)為1:20 ；日本臨床化學(xué)學(xué)會則為1:9 ；本人采用1:9，各干擾物原始濃度為測試濃度的10倍。原試驗(yàn)血漿9份加1份生理鹽水作為0干擾濃度，制成包括0濃度在內(nèi)的6個不同梯度的添加干擾物質(zhì)濃度，進(jìn)行同步測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以測定秒值或mg/L值及影響度（%）評價[5-6,11,31]。為了排除含不同濃度的干擾物對原試驗(yàn)血漿各項(xiàng)結(jié)果的影響，我們采用的干擾物為血清，而不是血漿。因血清中不含F(xiàn)IB，經(jīng)檢測PT、APTT均延長超出檢測范圍，可認(rèn)為不含凝血因子，而0干擾血漿加等量的生理鹽水。ACL TOP血凝分析儀采用先進(jìn)光電散射光法同時配合本底掃描及免疫濁度測定原理，根據(jù)待檢樣品在凝固過程中散射光的變化并扣去原始血漿標(biāo)本中原有色澤或濁度的百分比法來確定凝固終點(diǎn)的檢測方法，血漿同試劑快速離心混勻，在混合的瞬間，散射光最弱，從有散射光變化時將散射光強(qiáng)度置為0；隨著血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，標(biāo)本散射光強(qiáng)度也逐漸增加，當(dāng)標(biāo)本凝固完全以后，散射光的強(qiáng)度就穩(wěn)定下來，此時散射光最強(qiáng)，光變化完全停止時將散射光強(qiáng)度確定為100[15-16,18]。如血漿含色澤或濁度時，其0的基線點(diǎn)會自動抬高；遇低纖維蛋白原血癥，則0的基線點(diǎn)會自動降低[3,9,17]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，ACL TOP血凝分析儀精密度較理想，批內(nèi)和日間PT、APTT、TT、FIB的CV均<4.0%，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，滿足實(shí)驗(yàn)室檢測要求，避免了手工操作所造成的誤差和不可靠性。血漿測定值與靶值相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），表明儀器測定的準(zhǔn)確性良好。

對于干擾性試驗(yàn): ① 干擾物為Hb時，測定PT、APTT、 TT影響度在±3.5%之內(nèi)，F(xiàn)IB影響度為0～-7.2%，遠(yuǎn)小于美國CLIA'88提出的常見血凝儀分析指標(biāo)質(zhì)量要求（PT、APTT：靶值±15 % ；FIB：靶值±25 %）的標(biāo)準(zhǔn)[27-28]。② 干擾物為TBIL時，測定PT、TT、FIB影響度在±6%之內(nèi)，APTT影響度為0～-7.6%，也較為理想。由①、②得知ACL TOP 血凝儀對溶血、黃疸標(biāo)本有很強(qiáng)的抗干擾能力。③ 干擾物為TG時，測得TT、FIB的影響范圍在±6%之內(nèi)。TG在0～4.34mmol/L時，PT影響度為0～-13.5%；TG在6.52～10.86mmol/L時，PT影響度為-16.2%～-18.9%，超出美國CLIA'88質(zhì)量要求（PT:靶值±15 %）標(biāo)準(zhǔn)的范圍。TG在0～2.17mmol/L時，APTT影響度為0～-10.4%；TG在4.34～10.86mmol/L時，APTT影響度為-16.5%～-26.3%，超出美國CLIA'88質(zhì)量要求（APTT:靶值±15 %）標(biāo)準(zhǔn)的范圍。由③得知TG對TT、FIB無干擾，而高濃度的TG干擾PT、APTT的檢測， PT、APTT隨TG濃度的升高愈加降低，影響度愈大。關(guān)于各檢測項(xiàng)目的干擾情況：TBIL對PT影響度（±0.9%）最小，Hb對APTT、TT影響度（前者為0～-3.2%，后者為±1.7%）最小，TG對FIB影響度（0～-4.3%）最小。

從測定結(jié)果可以看出，高脂肪乳糜對ACL TOP血凝分析儀測定PT、APTT的結(jié)果有明顯的影響，可使PT、APTT測定結(jié)果偏低，導(dǎo)致影響度增大且呈非規(guī)則的遞增性波動，對測定方法起干擾效應(yīng)。這是由于：① 脂肪乳糜使血漿濁度過高，干擾測定過程，超過儀器檢測范圍時，導(dǎo)致儀器判定終點(diǎn)發(fā)生偏差不能檢測出結(jié)果或檢驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。②本試驗(yàn)主要測試的是對ACL TOP試劑的干擾，ACL TOP血凝分析儀配套試劑一個顯著的改變就是PT 、APTT試劑中的磷脂由人工合成， PT試劑中的組織因子采用基因工程重組技術(shù)制備[1,10,17]，推測TG可能會影響其中某些成分干擾測定[19-22]。常溫下采用高速離心（13000r/min，離心10 min）去除脂肪乳糜對血漿中凝血因子活性無影響。因此，常溫高速離心是一種簡便、易行的消除高脂肪乳糜對血凝分析儀測定結(jié)果的影響的方法[24,26,32]。另外，為減少脂血干擾誤差，對于抗凝藥物治療監(jiān)測APTT的患者應(yīng)空腹或固定的時間采集標(biāo)本[25,30]。

綜上所述，ACL TOP 血凝儀對溶血、黃疸標(biāo)本有很強(qiáng)的抗干擾能力。含低濃度TG（300μmol/L以下）的乳糜標(biāo)本，對測定的影響度小，屬于在正常范圍內(nèi)波動；但含有較高或高濃度TG的乳糜標(biāo)本，對PT、APTT測定過程和結(jié)果的影響度較大，反映ACL TOP在一定濃度范圍內(nèi)具有良好的抗乳糜干擾能力。這一結(jié)果不但給臨床醫(yī)生對病人的治療、判斷及預(yù)后提供了有效的血液凝固指標(biāo)，而且為設(shè)定新的止血和血栓指標(biāo)奠定了基礎(chǔ)[29]。

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