王玲 單保恩 張建彬

河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤研究所免疫室， 河北 石家莊 050011

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是近些年學者提出的一個新的乳腺癌亞型，該類乳腺癌具有發(fā)病年齡早、預后差、極易發(fā)生侵襲轉移的特點，其中超過70%的病例在明確診斷時已經(jīng)發(fā)生轉移，成為死亡的主要原因［1-2］。由于內(nèi)分泌治療和針對Her-2的靶向治療對TNBC無效，至今對TNBC仍缺乏令人滿意的綜合治療方案。因此，TNBC的復發(fā)和轉移是目前治療TNBC中亟待解決的問題。

塞來昔布(celecoxib)是一種新型非甾體類抗炎藥，選擇性抑制環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)，而對COX-1沒有抑制作用［3-4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布具有很好的抗腫瘤活性，可以抑制多種腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移［5-7］。我們前期的研究資料顯示，塞來昔布可以抑制人TNBC細胞MDA-MB-231細胞增殖、誘導細胞凋亡及細胞周期阻滯［8-9］，但關于塞來昔布是否對MDA-MB-231細胞侵襲行為產(chǎn)生影響目前還不清楚。為此，本研究以體外培養(yǎng)的人TNBC細胞MDA-MB-231為研究對象，觀察塞來昔布對MDA-MB-231細胞黏附、遷移以及侵襲能力的影響。評價塞來昔布用于臨床TNBC治療的可能性，為其臨床應用提供理論基礎和方法學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人TNBC細胞株MDA-MB-231購自中國科學院細胞庫上海保藏中心。胎牛血清購自杭州四季青公司。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Sigma公司。塞來昔布購自美國輝瑞有限公司。Matrigel膠購自美國BD Bioscience公司。Transwell侵襲小室購自美國Costar公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與實驗分組

用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的飽和濕度條件下進行培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，細胞生長呈70%～80%融合狀態(tài)時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，隔日換液，每3～4天傳代一次。塞來昔布溶解于DMSO，使用前用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋到所需的濃度，其中DMSO終濃度＜0.1%。實驗分為溶劑對照組和藥物干預組。以0.1%終濃度的DMSO作為溶劑對照組。藥物干預組塞來昔布終濃度分別為0、40、80、120 μmol/L。實驗時取對數(shù)生長期MDAMB-231細胞，根據(jù)不同實驗要求收集細胞。

1.3 細胞基質黏附實驗

實驗時取出預冷好的Matrigel膠，用無血清DMEM培養(yǎng)基將Matrigel稀釋成0.04 g/L備用，96孔培養(yǎng)板中每孔2 μg，37 ℃無菌風干過夜。每孔加入適量的無血清DMEM培養(yǎng)基，放置30 min，洗去多余的膠。取經(jīng)過0、40、80、120 μmol/L塞來昔布處理24 h的MDA-MB-231細胞，以每孔5×104個細胞接種在鋪膠的96孔板中，每組設6個復孔的平行對照。置37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的溫箱中培養(yǎng)2 h后，然后每孔加入MTT 20 μL (5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入DMSO 150 μL，在振蕩器上震蕩10 min，然后在酶標儀490 nm波長處讀取吸光度值(D)。以對照組細胞D值為參考，計算經(jīng)塞來昔布處理后細胞相對黏附率。相對黏附率(%)=(D實驗組/D對照組)×100%。

1.4 細胞劃痕實驗

收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，以2×105mL-1接種于24孔培養(yǎng)板中。待細胞長至80%左右融合時，更換無血清的DMEM，培養(yǎng)細胞24 h，用來饑餓細胞。待細胞長到完全融合時，用10 μL加樣槍頭在每孔單層細胞上劃痕，造成培養(yǎng)細胞劃痕模型。劃痕后用PBS沖洗2遍。沿劃痕邊緣等距離間隔做上標記，以便檢測。實驗分組同前，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，定時用倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合程度并拍照。計算越過0 h劃痕邊界的細胞數(shù)，并與對照組越過劃痕的細胞數(shù)相比計算百分率，以此反映細胞的平面遷移能力。以上實驗至少重復3次。

1.5 Transwell侵襲小室實驗

實驗采用帶有8 μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室，將Matrigel (50 mg/L)膠和無血清DMEM培養(yǎng)基以1∶3比例進行稀釋。在小室上室鋪100 μL稀釋好的Matrigel膠，37 ℃無菌保持過夜，確保Matrigel膠充分聚合。收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，用DMEM培養(yǎng)基調整細胞濃度為2×105mL-1，每孔加入200 μL細胞懸液于上室，用DMEM培養(yǎng)基補充至1 mL。下室加入預先培養(yǎng)MDA-MB-231細胞24 h后的上清液，每孔600 μL。實驗分組同前。孵育約24 h后，取出上室。用棉簽頭擦掉Matrige膠及膠上細胞，PBS液洗3次。24孔板中加入500 μL含5 g/L MTT的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37 ℃、4 h后取出。24孔板中加入500 μL DMSO，將小室置于其中，使膜浸沒在DMSO中，振蕩10 min，使MTT充分溶解。取出小室，于酶標儀上測D值。以上實驗重復3次。

1.6 RT-PCR檢測基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs) MMP-2及MMP-9 mRNA表達水平

按1.2實驗分組，取對數(shù)生長期的MDAMB-231細胞培養(yǎng)24 h后，提取細胞的總RNA，進行RNA完整性及純度的鑒定。使用反轉錄試劑盒，合成cDNA。以β-actin 為內(nèi)參照，β-actin的產(chǎn)物長度為838 bp，擴增β-actin引物序列：上游引物5’-ATCTGGCAC CACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’，下游引物5’-CGTCATCCCTGCTTGCTGATCCA CATCTGC-3’。擴增MMP-2引物序列：上游引物5’-GGATGATGCCTTTGCTCG -3’，下游引物5’-CAGTGGACATGGCGGTCT-3’，預期PCR產(chǎn)物大小為590 bp。擴增MMP-9引物序列：上游引物5’-AACTCACGCGCCAGTAGAAG-3’，下游引物：5’-GAGGTGGACCGGATGTTCC-3’，預期PCR產(chǎn)物大小為105 bp。

β-actin反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性50 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，32個循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，4 ℃終止。MMP-2反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性60 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，4 ℃終止。MMP-9反應條件：94 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，4 ℃終止。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物，直接加樣于1.5%瓊脂糖凝膠加樣孔中，80 V電壓，電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)分析并拍攝圖像，采用Gel-Pro Analyzer 3.1分析軟件分析條帶灰度值，mRNA表達相對值=目的片段灰度值/β-actin灰度值。

1.7 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差()表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗組與對照組比較用t檢驗，兩組以上數(shù)據(jù)比較用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 塞來昔布對人TNBC細胞MDA-MB-231黏附能力的影響

結果顯示，經(jīng)80、120 μmol/L塞來昔布作用24 h后，MDA-MB-231細胞對細胞外基質的相對黏附率分別為(50.2±7.3)%、(31.5±2.2)%，與未經(jīng)塞來昔布處理的對照組細胞相對黏附率［(96.8±10.9)%］相比明顯減少(P＜0.05)。說明塞來昔布能夠顯著抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的黏附力。

2.2 塞來昔布對人TNBC細胞MDA-MB-231遷移能力的影響

劃痕實驗結果顯示，對照組MDA-MB-231細胞24 h后向劃痕邊緣爬行的速度快，細胞鋪展迅速，劃痕的寬度明顯變窄，有些細胞已經(jīng)爬行至劃痕的中央。而經(jīng)40、80、120 μmol/L塞來昔布作用后，細胞向劃痕邊緣爬行的速度明顯減慢，劃痕缺損處修復緩慢。經(jīng)統(tǒng)計學處理，80和120 μmol/L實驗組越過劃痕的細胞數(shù)與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖1)。提示隨著塞來昔布藥物濃度的增加，細胞的平面運動能力明顯下降。

2.3 塞來昔布對人TNBC細胞MDA-MB-231侵襲能力的影響

Transwell侵襲小室實驗結果顯示，經(jīng)過塞來昔布處理后，通過人工基底膜的MDA-MB-231細胞的D值明顯降低。80和120 μmol/L塞來昔布作用后透過人工基底膜細胞的D值分別為0.561±0.072、0.318±0.056，與對照組(0.927±0.102)相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)?？梢娙麃砦舨紝DAMB-231細胞體外的侵襲力具有很強的抑制作用，且呈劑量依賴性。

2.4 塞來昔布對人TNBC細胞MDA-MB-231 MMP-2、MMP-9 mRNA表達的影響

RT-PCR檢測結果顯示，經(jīng)不同濃度(終濃度40、80、120 μmol/L)塞來昔布處理24 h后，MDA-MB-231細胞MMP-2 mRNA的相對表達水平分別為0.32±0.09、0.25±0.06和0.09±0.03，顯著低于對照組(0.48±0.12)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3)；MMP-9 mRNA的相對表達水平分別為0.41±0.05、0.28±0.03和0.13±0.02，其中80、120 μmol/L組顯著低于對照組(0.47±0.06)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖4)。

3 討 論

TNBC相對于其他類型的乳腺癌亞型而言，具有更高的侵襲和轉移特性，給治療帶來了極大的困難，每年都有大量患者因復發(fā)或轉移而死亡［10-11］。人TNBC細胞MDA-MB-231是一種高侵襲性、分化差、生長倍增速度快的乳腺癌細胞，經(jīng)常被用來建立人TNBC的裸鼠模型［12］。本實驗我們選取該細胞作為研究對象，觀察塞來昔布對該細胞體外侵襲轉移能力的影響。

目前研究認為，腫瘤的侵襲和轉移主要分為三步，細胞與基底膜的黏附、細胞外基質的降解和細胞的遷移［13-14］。因此，細胞與基底膜的黏附是腫瘤發(fā)生侵襲的前提和必要條件。本研究塞來昔布能抑制MDA-MB-231細胞的黏附，并呈劑量依賴性。在腫瘤的侵襲與轉移的過程中，腫瘤細胞必須穿過血管、淋巴管的基底膜才能進入血管和淋巴管，達到轉移的目的。因此，腫瘤細胞受趨化因素趨化并穿過基底膜的能力是侵襲和轉移的關鍵因素之一。我們采用正常培養(yǎng)MDA-MB-231細胞24 h的培養(yǎng)上清液作為趨化因素、Matrigel作為人工基底膜，通過Transwell侵襲小室觀察腫瘤細胞侵襲人工基底膜情況。結果顯示，用40 μmol/L塞來希布處理細胞24 h，細胞的體外趨化運動能力開始降低，但與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義；而80、120 μmol/L塞來昔布可以顯著地抑制細胞體外穿越人工基底膜的能力，減少細胞的趨化運動。腫瘤細胞與母體瘤分離，侵襲周邊正常組織時，需要一定的運動能力。劃痕實驗結果顯示經(jīng)塞來昔布作用后，細胞向劃痕中央遷移的速度明顯減慢，高劑量組藥物顯示對細胞遷移能力具有明顯抑制作用，并呈劑量-效應依賴性。最新的研究報道，塞來昔布可以抑制胰腺癌、口腔鱗狀細胞癌、食管鱗癌等多種腫瘤細胞的侵襲［15-17］。本部分的實驗結果也顯示，塞來昔布可以顯著地抑制人TNBC細胞MDA-MB-231的運動及侵襲能力，提示塞來昔布可能有利于防治TNBC的早期轉移。

MMPs是腫瘤細胞侵襲周邊正常組織中最為重要的一組蛋白酶。某些因素使MMPs在腫瘤細胞內(nèi)過表達，當其表達大于其抑制劑TIMPs時，這種平衡發(fā)生改變，會導致基質降解，腫瘤易發(fā)生浸潤和轉移［18-19］。多項研究已證實，MMP-2和MMP-9高表達與乳腺癌轉移密切相關，在發(fā)生早期轉移的乳腺癌患者中，這兩種蛋白酶的表達增高更為明顯［20-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布可以不同程度地降低MDA-MB-231細胞MMP-2、MMP-9的mRNA表達，從轉錄水平抑制腫瘤細胞酶的表達作用，防止過量的MMP集聚在細胞周圍，阻斷腫瘤細胞為其自身轉移創(chuàng)造條件。但關于塞來昔布對MMP-2、MMP-9轉錄后的調節(jié)機制，我們還在進一步實驗研究中。

本研究的結果表明，塞來昔布可以抑制人TNBC細胞株MDA-MB-231體外黏附、運動和侵襲能力，具有潛在的抑制腫瘤轉移的功能；這一功能可能與塞來昔布能降低腫瘤細胞內(nèi)MMP-2和MMP-9基因的表達有關。以上結果為臨床上塞來昔布防治TNBC的轉移提供了理論依據(jù)。

［1］Dawood S.Triple-negative breast cancer: epidemiology and management options ［J］.Drugs, 2010, 70(17): 2247-2258.

［2］Foulkes WD, Smith IE, Reis-Filho JS.Triple-negative breast cancer ［J］.N Engl J Med, 2010, 363(20): 1938-1948.

［3］Agrawal A, Fentiman IS.NSAIDs and breast cancer: a possible prevention and treatment strategy ［J］.Int J Clin Pract, 2008, 62(3): 444-449.

［4］O’Connor JP, Lysz T.Celecoxib, NSAIDs and the skeleton［J］.Drugs Today (Barc), 2008, 44(9): 693-709.

［5］Gao J, Jia WD, Li JS, et al.Combined inhibitory effects of celecoxib and fluvastatin on the growth of human hepatocellular carcinoma xenografts in nude mice ［J］.J Int Med Res, 2010, 38(4): 1413-1427.

［6］Chen J, Ran Y, Hong C, et al.Anti-cancer effects of Celecoxib on nasopharyngeal carcinoma HNE-1 cells expressing COX-2 oncoprotein ［J］.Cytotechnology, 2010, 62(5): 431-438.

［7］Park SW, Kim HS, Hah JW, et al.Celecoxib inhibits cell proliferation through the activation of ERK and p38 MAPK in head and neck squamous cell carcinoma cell lines ［J］.Anticancer Drugs, 2010, 21(9): 823-830.

［8］王玲, 劉麗宏, 單保恩, 等.Celecoxib下調NF-κB信號通路促進人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的體外研究［J］.癌癥, 2009, 28(6): 569-574.

［9］王玲, 張奇, 單保恩, 等.塞來昔布通過阻斷NF-κB信號通路誘導人乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞周期阻滯的相關研究［J］.中國癌癥雜志, 2009, 19(1): 33-38.

［10］Gluz O, Liedtke C, Gottschalk N, et al.Triple-negative breast cancer--current status and future directions ［J］.Ann Oncol, 2009, 20(12): 1913-1927.

［11］Hurvitz SA, Finn RS.What's positive about 'triple-negative’breast cancer? ［J］Future Oncol, 2009, 5(7): 1015-1025.

［12］Caldas-Lopes E, Cerchietti L, Ahn JH, et al.Hsp90 inhibitor PU-H71, a multimodal inhibitor of malignancy, induces complete responses in triple-negative breast cancer models［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106: 8368-8373.

［13］Makrilia N, Kollias A, Manolopoulos L, et al.Cell adhesion molecules: role and clinical significance in cancer ［J］.Cancer Invest, 2009, 27(10): 1023-1037.

［14］Condeelis J, Pollard JW.Macrophages: obligate partners for tumor cell migration, invasion, and metastasis ［J］.Cell,2006, 124(2): 263-266.

［15］Yip-Schneider MT, Wu H, Njoku V, et al.Effect of Celecoxib and the novel anti-cancer agent, dimethylamino-parthenolide,in a developmental model of pancreatic cancer ［J］.Pancreas, 2008, 37(3): e45-e53.

［16］Szumi?o J, Burdan F, Szumi?o M, et al.Cyclooxygenase inhibitors in chemoprevention and treatment of esophageal squamous cell carcinoma ［J］.Pol Merkur Lekarski, 2009,27(161): 408-412.

［17］Kwak YE, Jeon NK, Kim J, et al.The cyclooxygenase-2 selective inhibitor Celecoxib suppresses proliferation and invasiveness in the human oral squamous carcinoma ［J］.Ann N Y Acad Sci, 2007, 1095: 99-112.

［18］Polette M, Birembaut P.Membrane-type metalloproteinases in tumor invasion ［J］.Int J Biochem Cell Biol, 1998, 30(11):1195-1202.

［19］Ohbayashi H.Matrix metalloproteinases in lung diseases［J］.Curr Protein Pept Sci, 2002, 3(4): 409-421.

［20］Turpeenniemi-Hujanen T.Gelatinases (MMP-2 and -9)and their natural inhibitors as prognostic indicators in solid cancers ［J］.Biochimie, 2005, 87(3-4): 287-297.

［21］Jezierska A, Motyl T.Matrix metalloproteinase-2 involvement in breast cancer progression: a mini-review ［J］.Med Sci Monit, 2009, 15(2): RA32-RA40.

［22］Luo J.Role of matrix metalloproteinase-2 in ethanol-induced invasion by breast cancer cells ［J］.J Gastroenterol Hepatol,2006, 21 Suppl 3: S65-S68.