王文軍,溫江濤

(連云港市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇連云港222001)

本研究以Th17細(xì)胞為研究對(duì)象,對(duì)40例原發(fā)性干燥綜合征(pSS)患者及40例正常對(duì)照組外周血Thl7細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),并分析其與免疫指標(biāo)及唇腺病理分級(jí)的相關(guān)性,以探討其在pSS發(fā)病機(jī)制中的作用以及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 pSS患者為2008年1月至2009年10月連云港市第二人民醫(yī)院風(fēng)濕科住院的患者,診斷標(biāo)準(zhǔn)為2002年原發(fā)性干燥綜合癥國(guó)際分類(診斷)標(biāo)準(zhǔn)[1]。共收集到pSS患者40例,其中女性35例,男性5例 ,年齡 17-75歲 ,平均(49±13)歲 ;病程10個(gè)月-9年,平均(4±5)年。正常對(duì)照組40名,為我院體檢中心健康體檢者,無自免疾病病家族史,其中女性35名,男性5名,年齡18-67歲,平均(48±15)歲。

1.2 主要儀器和試劑 熒光素標(biāo)記的抗體:藻紅蛋白(PE)標(biāo)記抗人IL-17及同型對(duì)照購(gòu)自eBioscience公司;佛波酯(PMA)、離子霉素(Ion)購(gòu)自 sigmaaldrich公司;免疫磁珠陰選試劑盒購(gòu)自美天旎(Miltenyi Biotec)公司、固定與透膜試劑盒購(gòu)自Beckman Coulter公司;淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)購(gòu)自加拿大CEDARLANE Laboratories Limited 公司;RPMI 1640、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司;抗核抗體(ANA)檢測(cè)試劑盒、抗SSA抗體、抗SSB抗體免疫印跡檢測(cè)試劑盒(Euroimmun公司產(chǎn)品);C3、C4試劑盒(Beckman Coulter公司)。Beckman Coulter Epics XL流式細(xì)胞儀,Olympus BX50熒光顯微鏡,Beckman Coulter Immage特定蛋白分析儀。

1.3 Thl7細(xì)胞檢測(cè) 用Ficoll液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),依據(jù)免疫磁珠陰選試劑盒操作說明分選出CD4+T細(xì)胞,用含10%FBS的1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞(終濃度為1×106/ml),分別加入PMA 50 ng/ml、Ion 1 μ g/ml及阻斷劑奠能霉素,在 37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)5 h,然后取細(xì)胞懸液加入100 μ l固定劑A,避光反應(yīng)15min,冷PBS洗滌1次,再加入透膜劑B100 μ l,反應(yīng) 5 min,加入 10 μ l PE 標(biāo)記的抗人 IL-17抗體,設(shè)同型對(duì)照反應(yīng)管,避光反應(yīng)30 min后,PBS洗滌2次,以 500 μ l冷 PBS重懸,進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FCM)測(cè)定,結(jié)果用system Ⅱ軟件分析。

1.4 抗SSA抗體、抗SSB抗體采用免疫印跡法測(cè)定 C3、C4測(cè)定采用免疫散射比濁法;抗ANA采用免疫熒光法測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包分析數(shù)據(jù),兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),變量間的相關(guān)性應(yīng)用直線相關(guān)分析,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pSS組與健康對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞表達(dá)水平 pSS組Th17細(xì)胞水平為(2.14±0.91),健康對(duì)照組為(0.56±0.21),pSS組顯著高于健康對(duì)照組(P＜0.01)。

2.2 pSS患者外周血Th17細(xì)胞表達(dá)與血清抗SSA、抗SSB、ANA、C3、C4相關(guān)性 對(duì)pSS患者Th17細(xì)胞表達(dá)水平分別與血清ANA滴度、抗SSA、抗SSB、C3、C4含量進(jìn)行直線相關(guān)分析,結(jié)果與相關(guān)免疫指標(biāo)均與無相關(guān)性(P＞0.05),見表1。

表1 pSS患者外周血Th17細(xì)胞表達(dá)水平與疾病相關(guān)參數(shù)相關(guān)分析

2.3 唇腺病理分級(jí)對(duì)Th17細(xì)胞水平的影響 患者均進(jìn)行下唇唇腺病理活檢,根據(jù)唇腺活檢病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),將唇腺病理變化分為1-4級(jí)。本組40例患者唇腺病理結(jié)果為1級(jí)1例,2級(jí)9例,3級(jí)16例,4級(jí)14例(見表2)。比較不同唇腺病理分級(jí)患者的Th17細(xì)胞水平,發(fā)現(xiàn)各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 pSS患者不同唇腺病理分級(jí)與外周血Th17細(xì)胞表達(dá)水平的比較

3 討論

大量研究證實(shí)TH17細(xì)胞與自身免疫疾病之間的關(guān)鍵紐帶即為 IL-17因子。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、多發(fā)性硬化癥(MS)、哮喘等疾病中IL-17的表達(dá)均增加。其中,IL-17在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的研究最為深入。早期認(rèn)為IL-17作為一類促炎因子的在RA中僅僅是起到加強(qiáng)炎癥作用。然而,近來有關(guān)人、鼠關(guān)節(jié)移植的研究提示IL-17自身能夠刺激炎癥反應(yīng)的發(fā)生[2],并且引發(fā)一系列后續(xù)的病理反應(yīng)。最近研究還發(fā)現(xiàn)RA患者關(guān)節(jié)滑液中IL-17的含量明顯高于骨性關(guān)節(jié)炎患者滑液中的IL-17含量[3]。因此Th17細(xì)胞很可能在自身免疫反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。

pSS是一種以侵犯淚腺、唾液腺為主的自身免疫性疾病,它不僅侵犯外分泌腺體,還可侵犯全身多個(gè)器官,產(chǎn)生多種多樣的臨床表現(xiàn)。目前認(rèn)為該病病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確。本研究對(duì)臨床40例pSS患者檢測(cè)結(jié)果表明,其外周血Th17細(xì)胞表達(dá)水平顯著升高,與健康對(duì)照組比較存在顯著差異(P＜0.01)。同時(shí)本研究還分析了pSS患者外周血Th17細(xì)胞表達(dá)水平與血清抗SSA、抗SSB、ANA滴度、C3、C4含量進(jìn)行直線相關(guān)分析,結(jié)果表明Th17細(xì)胞水平與疾病相關(guān)參數(shù)無相關(guān)性(P＞0.05)。本研究還將Th17細(xì)胞水平與唇腺病理進(jìn)行了相關(guān)分析,結(jié)果表明兩者之間并無顯著性相關(guān)。雖然Th17細(xì)胞異常增加與pSS諸多臨床參數(shù)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性,但我們認(rèn)為Th17細(xì)胞異常增加對(duì)pSS的發(fā)生、發(fā)展有調(diào)控作用?；罨腡h17細(xì)胞通過分泌IL-17,IL-21、IL-6等因子發(fā)揮其促炎功能,而pSS發(fā)病的主要特點(diǎn)就是通過炎癥作用損傷靶器官。因此在pSS的炎癥過程中TH17細(xì)胞必然起到重要作用。但是pSS發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,牽涉炎癥因子網(wǎng)絡(luò)非常龐大,而Th17細(xì)胞增多只是其中的一個(gè)環(huán)節(jié)[4,5]。同時(shí)本研究所涉及炎癥因子及臨床參數(shù)較少,所以Th17細(xì)胞究竟通過什么樣的機(jī)制參與pSS的發(fā)病需進(jìn)一步探索。

[1]Vitali C,Bombardieri S,Jonsson R,et al.Classificationc riteria for Sjogren's syndrome:a revised version of the European criteria proposed by the American-European Consensus Group[J].Ann Rheum Dis,2002,61:554.

[2]Kolls JK,Linden A.Interleukin-17 family members and inflammation[J].Immunity,2004,21(4):467.

[3]Chabaud M,Lubberts E,Joosten L,et al.IL-17 derived from juxtaarticular bone and synovium contributes to joint degradation in rhenmatoid arthritis[J].Arthritis Res,2001,3(3):168.

[4]Fox RI,Stern M,Michelson P.Update in sjogren's syndrome[J].Curr Opin Rheumatol,2000,12(5):391.

[5]Bolstad AI,Wassmuth R,Haga HJ,et al.HLA markers and clinical characteristics in Caucasianswith primary sjogren's syndrome[J].J Rheumatol,2001,28(7):1554.