于 瓊，吳 鐵，崔 燎，2

(1.廣東醫(yī)學院藥學院，廣東東莞 523808;2.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東湛江 524023)

環(huán)磷酰胺(cyclophsphamide，CP)作為抗腫瘤和免疫抑制劑已在臨床廣泛應用，療效確切，但也伴隨多臟器毒性，曾被報道能使人的骨密度迅速減少，繼而出現(xiàn)骨質疏松［1］。本項目組曾用環(huán)磷酰胺分別建立了大鼠和小鼠低轉換型的骨質疏松動物模型［2-3］，探討環(huán)磷酰胺對骨的影響，并試圖通過該模型來篩選能促進骨形成，防治老年性骨質疏松的藥物。阿司匹林(aspirin，AS)作為百年老藥，有著極其神奇的一面，它能參與多種生理活動，又可在不同劑量下表現(xiàn)出不同的作用機制。Carbone等［4］的調查表明，服用阿司匹林的人往往具有著更高的骨密度。給予糖尿病大鼠100 mg·d-1的阿司匹林可有效提高其腰椎骨的骨密度和骨質量［5］;早在1991年就曾報道阿司匹林可影響正常大鼠的骨再建過程，而且存在明顯的劑量依賴性［6］，但該研究僅停留在了大劑量上，其結果表現(xiàn)出骨代謝抑制作用［7］，而對中、低劑量卻未能涉及。本實驗用環(huán)磷酰胺作為工具藥物造成大鼠的骨質疏松模型，通過骨形態(tài)計量學，骨生物力學，骨有機質成分檢測等方法來觀察中、低劑量的阿司匹林對大鼠脛骨中段骨和股骨等皮質骨材料的作用效果，并與陽性對照藥物碳酸鈣維D進行比較，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑

1.1.1藥品 阿司匹林(藥用原料藥):由山東新華制藥股份有限公司提供，使用時用少量乙醇促溶后用生理鹽水調整到實驗室所需濃度。中劑量是根據(jù)體表面積法由正常成人500 mg日用量換算而來，稀釋5倍為低劑量。環(huán)磷酰胺:江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號:403501。碳酸鈣維D片:美國安士制藥公司，批號:5B16656，每片相當于鈣300 mg，Vit D 100單位。

1.1.2試劑 鹽酸四環(huán)素:上海新亞制藥廠生產，批號:891224-18;甲基丙烯酸甲酯:北京化工廠生產，批號:940117;Calcein(Sigma chemical Co.USA，lot:61F0527);羥脯氨酸試劑盒(堿水解法，南京建成生物技術有限公司)。

1.2實驗儀器低速鋸(Buehler LTD USA)，Leica組織切片機(德國)，LEICA QWN半自動圖像分析儀(德國萊卡)，電感偶合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP，美國TJA公司)，UV-752紫外分光光度計(上海第三醫(yī)學儀器廠)，858 Mini Bionix型材料測試系統(tǒng)(MTS，美國)。

1.3實驗方法

1.3.1實驗動物與分組 3月齡的SD大鼠，50只，♀♂各半，體質量(208±28)g，由廣東醫(yī)學院實驗動物中心提供，SPF級，動物合格證號:2005A023。按體重對等原則隨即分成5組，每組10只。正常對照組(NS組):該組大鼠每天灌胃給予5 ml·kg-1·d-1生理鹽水。環(huán)磷酰胺模型組(CP組)，該組大鼠每天灌胃給予環(huán)磷酰胺4.5 mg·kg-1·d-1。陽性藥物對照組(CS組)，該組大鼠每天灌胃給予環(huán)磷酰胺4.5 mg·kg-1·d-1及碳酸鈣維D 0.4 mg·kg-1·d-1。中劑量阿司匹林組(DAS組):該組大鼠每天灌胃給予環(huán)磷酰胺4.5 mg·kg-1·d-1及阿司匹林45 mg·kg-1·d-1。低劑量阿司匹林組(LAS組):該組大鼠每天灌胃給予環(huán)磷酰胺4.5mg·kg-1·d-1及阿司匹林9 mg·kg-1·d-1。5 組動物均自由飲水和進食標準飼料。共給藥15 d，實驗結束后，取左側脛骨中段骨浸泡于4%的甲醛中24 h，按不脫鈣法包埋、磨片后進行骨組織形態(tài)計量學測量;取右側股骨生理鹽水紗布，錫紙包裹，-20℃保存，待骨生物力學檢測及骨有機質和礦物含量檢測。

1.3.2骨組織形態(tài)計量學測量［8］依方法在骨組織形成雙熒光標記，不脫鈣法包埋、磨片，進行骨組織形態(tài)計量學測量。骨組織形態(tài)計量學靜態(tài)參數(shù)包括:皮質面積(Ct.Ar)，皮質面積百分率(%Ct.Ar)，骨髓面積百分率(%Ma.Ar);動態(tài)參數(shù)包括骨外膜標記周長百分率(%P-L.Pm)，骨外膜骨礦化沉積率(P-MAR)，骨外膜骨形成率(P-BFR/BS)，骨內膜標記周長百分率(%E-L.Pm)，骨內膜骨礦化沉積率(E-MAR)，骨內膜骨形成率(E-BFR/BS)。

1.3.3骨生物力學檢測［9］檢測時，將-20℃保存的骨材料常溫解凍，生理鹽水復濕。用858 Mini Bionix型材料測試系統(tǒng)監(jiān)測和分析大鼠右側股骨的生物力學性能。將股骨置于流變儀上分別進行三點彎曲試驗，加載速度為0.01 mm·s-1，跨距為15 mm。記錄載荷-變形曲線，從曲線上直接獲取或依公式計算出相應的力學指標:彈性載荷(使骨骼發(fā)生彎曲變形時所加載的外力);最大載荷(骨骼發(fā)生骨折所承受的最大外力);剛性系數(shù)(骨硬度指標，反映抗變形的能力);韌性系數(shù)(骨塑性指標，反映骨的韌度);彈性模量(骨內在硬度，與骨骼的幾何形狀和尺寸無關)。

1.3.4骨基質成分檢測 將生物力學檢測后的骨材料80℃烘干至恒重，用AE240電子天平稱重;然后，每份骨樣本加6 mol·L-1HCl在108℃溫度下消化16 h后，把消化液分成兩份。一份稀釋后用ICP儀測定骨Ca、P的含量，與骨干重進行比較，用骨礦物元素量(mg)/骨干重(g)的比值來作為骨礦物質含量的指標，骨礦物元素量/骨干重的比值越大，說明骨礦物質在骨中所占的比例越大。另一份消化液過濾后調pH值至6，然后，經典法測定羥脯氨酸吸光度，在標準曲線中讀出其含量。

1.3.5數(shù)據(jù)處理參數(shù)值用±s表示，采用SPSS 11.0軟件進行分析。

2 結果

2.1阿司匹林對環(huán)磷酰胺大鼠皮質骨骨組織形態(tài)學的影響

2.1.1阿司匹林對環(huán)磷酰胺大鼠脛骨中段骨組織形態(tài)學靜態(tài)參數(shù)的影響 與NS組相比，脛骨中段皮質骨的骨靜態(tài)參數(shù)中%Ct.Ar(皮質面積百分率)明顯下降(P＜0.05)，%Ma.Ar(骨髓面積百分率)明顯增加(P＜0.05)，提示環(huán)磷酰胺可致使大鼠中段骨管壁變薄，骨髓腔明顯增大，皮質骨體積減少。而中、低劑量的阿司匹林與碳酸鈣維D均可有效的對抗環(huán)磷酰胺所造成的大鼠皮質骨丟失，骨髓腔擴大。各組大鼠脛骨中段骨組織形態(tài)學靜態(tài)參數(shù)的改變見Tab 1。

Tab 1 Effect of aspirin in the static histomorphometry paramerers of cortical bone in CP-treated rats(n=10)

2.1.2阿司匹林對環(huán)磷酰胺大鼠脛骨中段骨組織形態(tài)學動態(tài)參數(shù)的影響 與NS組相比，CP組大鼠脛骨中段皮質骨的骨動態(tài)參數(shù)中P-MAR(骨外膜骨礦化沉積率)，P-BFR/BS(骨外膜骨形成率)明顯下降(P＜0.05)，而對內膜參數(shù)沒有明顯影響;提示環(huán)磷酰胺能明顯抑制大鼠皮質骨外膜的骨形成和礦化作用，對內膜骨形成的影響不明顯。而中、低劑量的阿司匹林與碳酸鈣維D均可有效的對抗環(huán)磷酰胺對大鼠皮質骨外膜的成骨抑制作用。各組大鼠脛骨中段骨組織形態(tài)學動態(tài)參數(shù)的改變見Tab 2。

2.2阿司匹林對環(huán)磷酰胺大鼠股骨骨生物力學指標的影響與NS組相比，CP組大鼠股骨骨生物力學指標中彈性載荷、最大載荷、剛性系數(shù)等均下降(P＜0.05)，彈性模量和韌性系數(shù)無改變;提示環(huán)磷酰胺大鼠股骨韌性(韌性系數(shù))無改變，但其整體的抗變形(彈性載荷、剛性系數(shù))和抗骨折(最大載荷)的能力下降，而這種下降是與股骨的形狀、尺寸等結構因素相關的，所以其內在的抗變形能力(彈性模量)降低不明顯。與CP組比較，CS組的彈性載荷、最大載荷、剛性系數(shù)均有效增加(P＜0.05)，彈性模量無改變，韌性系數(shù)下降(P＜0.01);提示碳酸鈣維D可有效的增加大鼠股骨的抗變形和抗骨折能力，而這種效果是與改善股骨的形狀尺寸等結構因素有關，但同時也會致使股骨的韌性下降。與CP組比較，MAS組的彈性載荷、剛性系數(shù)明顯增加，韌性系性系數(shù)下降(P＜0.05)，最大載荷和彈性模量有上升趨勢，但差異無顯著性;提示中劑量的阿司匹林僅能有效地增加環(huán)磷酰胺大鼠股骨的整體的抗彎曲能力，且與改善股骨的形狀尺寸等結構因素有關，同時會使股骨的韌性減弱，而抗骨折能力沒有明顯增強。與CP組比較，LAS組除韌性系數(shù)外的指標均能有效增加(P＜0.05);提示小劑量的阿司匹林同時改善環(huán)磷酰胺大鼠股骨的內在和外在的抗彎曲能力，且韌性系數(shù)也無下降，抗骨折能力增強。各組大鼠股骨生物力學指標的改變見Tab 3。

Tab 2 Effect of aspirin on the dynamic histomorphometry paramerers of cortical bone in CP-treated rats(n=10)

Tab 3 Effect of aspirin on biomechanics of vitodynamics in CP-treated rats(n=10)

Tab 4 Effect of aspirin on bone matrix of femur in CP-treated rats(n=10)

2.3阿司匹林對環(huán)磷酰胺大鼠股骨骨基質成分的影響與NS組相比，CP組的Hyp、Ca2+和P3+均明顯下降(P＜0.05)，而 Ca2+/Hyp和 Ca2+/P3+沒有明顯改變;說明環(huán)磷酰胺使大鼠股骨的有機質和無機物以及無機物中的鈣和磷均為同比例丟失。與CP組相比，CS組、MAS組和LAS組的Hyp、Ca2+和P3+均明顯增加，Ca2+/Hyp明顯降低(P＜0.05)，Ca2+/P3+有下降趨勢，但差異無顯著性;提示碳酸鈣維D以及中、低劑量的阿司匹林均可有效地對抗環(huán)磷酰胺大鼠骨基質的丟失，且有機質的增加大于無機物的增加，而無機物的增加中骨磷稍多于骨鈣，但基本為同比例。各組大鼠股骨骨基質成分的改變見Tab 4。

3 討論

由Tab 2的結果可知，5組大鼠皮質骨的%E-L.Pm僅為%P-L.Pm的15%左右，且數(shù)值小，標準差大，說明大鼠正處于成熟前的骨建造期，而內膜的骨重建不明顯。由Tab 1和Tab 2，CP組對比NS組的實驗結果可知，環(huán)磷酰胺抑制了大鼠皮質骨外膜的形成礦化，使骨骼的向外生長減慢，脛骨骨干變細。同時，大鼠皮質骨內膜的骨吸收作用仍在，脛骨骨髓腔擴大，皮質骨進一步減少。骨生物力學包括結構力學和材料力學兩種指標，前者是評價骨骼的整體質量，而后者則是評價骨骼的內在質量，排除了骨骼形狀和尺寸等因素的影響［9］。由Tab 3中的實驗結果可知，環(huán)磷酰胺可致使大鼠的彈性載荷，最大載荷等骨結構力學性能明顯下降，但彈性模量這材料力學指標卻沒有明顯改變;說明環(huán)磷酰胺造成的大鼠股骨骨質量下降與皮質骨的形狀尺寸有關，這個結果也與前面CP組大鼠骨組織靜態(tài)參數(shù)的結果相符。骨基質包括膠原物質的骨有機質和鈣磷等礦物質的骨無機物兩大部分。由Tab 4中CP組對比NS組的實驗結果可知，CP組大鼠股骨的有機質和無機物以及無機物中的鈣和磷均為同比例丟失;說明環(huán)磷酰胺對成骨細胞分泌膠原和促進礦化的作用均產生了抑制。雖然生長期大鼠皮質骨的生長特點與老年人類存在差別，但由上述的結果，我們發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺大鼠皮質骨的改變與人類因年齡增長而發(fā)生骨質疏松的皮質骨部分的病變特點一致，所以我們可以用該模型來篩選防治老年性骨質疏松的藥物。

由CS組對比CP組的實驗結果可知，碳酸鈣維D能有效對抗環(huán)磷酰胺致大鼠皮質骨的一系列病變。我們以前的研究也發(fā)現(xiàn)鈣劑與維生素D聯(lián)用可防治環(huán)磷酰胺小鼠骨丟失［3］。補充鈣與維生素D是防治老年性骨質疏松的基礎治療方法，目前認為其作用機制主要包括維生素D3在體內可轉化為具有促進骨形成活性1，25-(OH)2D3，以及鈣的補充可保證充足的礦物質沉積到骨骼，幫助骨骼礦化。而這個實驗結果也可從側面佐證環(huán)磷酰胺誘導的大鼠骨質疏松模型是抑制成骨細胞活性為主的低轉換型骨質疏松，其機制類似于老年性的骨質疏松。

由MAS組、LAS組對比CP組的實驗結果可知，中、低劑量的阿司匹林均可有效地促進環(huán)磷酰胺大鼠皮質骨的骨形成礦化作用，從而避免了因成骨不足而引起的骨髓腔擴大，皮質骨管壁變薄，骨有機質和無機物等比例丟失等現(xiàn)象，且中、低兩種劑量的作用無明顯區(qū)別，均與碳酸鈣維D的效果相當。其作用機制可能與阿司匹林抗氧化損傷作用有關［10］。由Tab 3的結果可知，阿司匹林在對抗環(huán)磷酰胺對大鼠皮質骨質量的影響上，低劑量的效果要優(yōu)于中劑量，特別是對骨韌性和骨材料力學性能的作用上效果比碳酸鈣維D更佳。低劑量的阿司匹林(相當于正常人100 mg·d-1)不僅能有效地修復環(huán)磷酰胺大鼠股骨抗變形和抗骨折等能力，不會降低骨的韌性，而且同時提高了骨材料力學的性能，即低劑量的阿司匹林對大鼠骨質量修復的作用除了增加皮質骨體積，使骨結構變粗之外，同時也改善了骨骼的微觀結構，增加單位骨量，使整體和單位體積皮質骨的質量均能有效提高。而這個劑量也恰好是阿司匹林在預防心血管事件中的推薦劑量(75～150 mg·d-1)，這或許能給阿司匹林在臨床上的應用提供一些新的提示。而阿司匹林能否作為抗骨質疏松藥物應用于臨床，其促骨形成的作用原理如何?以及能否對其進行結構修飾，或與其他藥物聯(lián)合應用來發(fā)揮更好的抗骨質疏松效果?均有待進一步的研究探討。

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