焦士勇，艾常虹，李艾芳，李 樺，王 旗

(1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系，北京 100191;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850)

中藥補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)，具有溫腎助陽，納氣平喘，溫脾止瀉的功效［1］。補(bǔ)骨脂酚(bakuchiol)是補(bǔ)骨脂的主要成分之一，在補(bǔ)骨脂藥材中的含量為1.12%～5.14%［2］，是一種單萜類化合物，常溫下為淺黃色油狀液體，化學(xué)結(jié)構(gòu)如Fig 1所示。補(bǔ)骨脂酚具有抗炎退熱［3］、抗菌［4］、抗病毒［5］、抗癌［6］、保肝［7］和雌激素樣作用［8］等藥理活性。

Fig 1 Chemical structure of bakuchiol

張玉順等［9］給昆明種小鼠灌胃約9.4 g·kg-1的生藥后發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂酚有一定的腎毒性作用。江芳等［10］在體外也觀察到 20 μmol·L-1以上濃度的補(bǔ)骨脂酚對人腎近曲小管上皮細(xì)胞(human kedney-2，HK-2)有明顯的腎毒性作用，加入大鼠肝勻漿S9代謝活化后，補(bǔ)骨脂酚的細(xì)胞毒性作用明顯降低，提示肝臟藥物代謝酶對補(bǔ)骨脂酚有一定的減毒作用，補(bǔ)骨脂酚經(jīng)代謝可能轉(zhuǎn)化為無毒或低毒的物質(zhì)。補(bǔ)骨脂酚的代謝研究目前僅見SD大鼠口服補(bǔ)骨脂酚的藥代動(dòng)力學(xué)［11］，補(bǔ)骨脂酚的肝臟代謝產(chǎn)物，代謝的種屬差異以及代謝與毒性的關(guān)系尚未見報(bào)道。為了更好地理解補(bǔ)骨脂酚的肝代謝與腎毒性之間的關(guān)系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體之間可能存在的差異，本文用大鼠、比格犬和人肝微粒體研究了3個(gè)種屬微粒體對補(bǔ)骨脂酚HK-2細(xì)胞的減毒作用，以及補(bǔ)骨脂酚的體外肝代謝穩(wěn)定性及代謝動(dòng)力學(xué)，并比較了種屬間差異。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑補(bǔ)骨脂酚購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度＞99%，批號為090427;丹參酮ⅡA(內(nèi)標(biāo))購自中國藥品生物制品檢定所;♂ SD大鼠和比格犬肝微粒體、及♂人肝微粒體均購自北京慧智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司，蛋白含量為20 g·L-1，批號:7MMC002;D/F12(DMEM ∶F12=1 ∶1)培養(yǎng)基購自北京清大天一生物科技有限公司;1∶250胰蛋白酶為Amresco公司產(chǎn)品;甲醇(Sigma)和乙腈(J＆Kchemica)為色譜純，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器Waters高效液相色譜儀系統(tǒng)配有Wa-ters1525泵、717 Puls自動(dòng)進(jìn)樣器和2487雙波長紫外檢測器(美國Waters公司);Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司);Cary Win UV300紫外可見分光光度計(jì)(美國Agilent公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)HK-2細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，細(xì)胞培養(yǎng)用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，內(nèi)含2 mmol·L-1非必需氨基酸、100 kU·L-1的青霉素和鏈霉素，于5%CO2，37℃，恒濕條件下培養(yǎng)，細(xì)胞融合80%后用胰蛋白酶/EDTA消化傳代。

1.4肝微粒體對補(bǔ)骨脂酚HK-2細(xì)胞毒性的影響實(shí)驗(yàn)分組如下:空白對照組:不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基;溶劑對照組:體積分?jǐn)?shù)為0.5%DMSO;肝微粒體對照組:蛋白濃度為0.16 g·L-1鼠(犬或人)肝微粒體+0.5%DMSO;補(bǔ)骨脂酚組:10、20、30、40、50 μmol·L-1;補(bǔ)骨脂酚 + 蛋白濃度為 0.16 g·L-1鼠(犬或人)肝微粒體組:10、20、30、40、50 μmol·L-1;含有微粒體的樣品均在冰浴上配制，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行樣。

取生長融合達(dá)80%的細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1的胰蛋白酶消化，配制單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為3×105·L-1，每孔100 μl種于96 孔板，培養(yǎng)12 h后加入100 μl上述各組受試藥物，補(bǔ)骨脂酚加微粒體組將受試藥與微粒體同時(shí)加入細(xì)胞培養(yǎng)液，與HK-2細(xì)胞共孵4 h后換上含有0.5 g·L-1MTT的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h后將上清液棄去，每孔加入150 μl體積分?jǐn)?shù)為4%酸性異丙醇，37℃恒溫15 min后，于570 nm用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5HPLC法定量測定補(bǔ)骨脂酚補(bǔ)骨脂酚及內(nèi)標(biāo)應(yīng)用 XB-C18 色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm，美國Welch公司)分離，流動(dòng)相為水-甲醇(11∶89，V∶V;含0.1%甲酸)，流速為1 ml·min-1，檢測波長262 nm。

1.6補(bǔ)骨脂酚在肝微粒體孵育體系中的代謝消除孵育體系用50 mmol·L-1K2HPO4溶液(pH=7.4)配制，其中含蛋白濃度為0.5 g·L-1的各種屬微粒體和初始濃度為10 μmol·L-1的補(bǔ)骨脂酚，在37℃預(yù)孵育5 min，加入同樣預(yù)孵育5 min的NADPH(10 mmol·L-1)溶液啟動(dòng)反應(yīng)，于0、2、5、10、20、30和60 min分別取樣，立即加入冰冷的含有內(nèi)標(biāo)(0.5 μmol·L-1丹參酮ⅡA)的甲醇 -乙腈(1 ∶1，V∶V)溶液 200 μl終止反應(yīng)，渦旋混勻 2 min，于20 200×g，4 ℃離心 10 min，取上清 10 μl HPLC 檢測補(bǔ)骨脂酚的剩余含量，計(jì)算代謝消除半衰期等參數(shù)。對照為不加NADPH的酶反應(yīng)組。

1.7補(bǔ)骨脂酚的肝微粒體代謝動(dòng)力學(xué)反應(yīng)體系中各種屬微粒體蛋白含量為0.5 g·L-1，補(bǔ)骨脂酚的終濃度分別為2、4、8、16 和32 μmol·L-1，比格犬和人微粒體組于10 min終止反應(yīng)，大鼠微粒體組因藥物轉(zhuǎn)化速率較快故于2 min終止反應(yīng)。0時(shí)組先在孵育液中加入終止液后再加NADPH溶液。樣品按“1.6”節(jié)的方法處理后用HPLC檢測補(bǔ)骨脂酚的剩余含量，計(jì)算酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax。

1.8數(shù)據(jù)處理與分析以溶劑對照組的細(xì)胞存活率為100%，由公式(1)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率。

以0時(shí)的補(bǔ)骨脂酚濃度為100%，由不同時(shí)間點(diǎn)的補(bǔ)骨脂酚剩余濃度與0時(shí)濃度相比得到其剩余百分比。以各時(shí)間點(diǎn)補(bǔ)骨脂酚剩余百分比的自然對數(shù)對反應(yīng)時(shí)間作圖，經(jīng)直線回歸求得斜率(-k)，由公式(2)得到補(bǔ)骨脂酚的代謝消除，應(yīng)用 Wellstirred模型對微粒體的數(shù)據(jù)進(jìn)行外推［12］得到補(bǔ)骨脂酚在人、大鼠和比格犬肝中的固有清除率CLint(ml·min-1·kg-1)和肝清除率CLh(ml·min-1·kg-1)。

其中，SF為換算因子，Gmicrs代表肝臟中含有的微粒體蛋白的平均質(zhì)量(mg);Wliver代表肝重(g);Wbody代表體重(kg);Gprotein代表反應(yīng)體系中蛋白濃度(mg·ml-1);Qh肝血流速。相關(guān)動(dòng)物理化參數(shù)的經(jīng)驗(yàn)值引自文獻(xiàn)［13］。

由Line weaver-Burk模型計(jì)算補(bǔ)骨脂酚在3個(gè)種屬微粒體中的米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax)。

2 結(jié)果

2.1補(bǔ)骨脂酚的HPLC檢測方法學(xué)及驗(yàn)證在現(xiàn)有的色譜條件下，補(bǔ)骨脂酚及內(nèi)標(biāo)峰達(dá)到基線分離，微粒體基質(zhì)中的內(nèi)源物不影響其分離和定量。補(bǔ)骨脂酚在0.1～10 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r＞0.99，定量下限為 0.1 μmol·L-1，低、中和高 3 個(gè)濃度(2.5、5 和 10 μmol·L-1)的日內(nèi)和日間精密度分別小于3.0%和4.5%，回收率＞90%，方法能夠滿足檢測要求。

2.2不同種屬肝微粒體對補(bǔ)骨脂酚HK-2細(xì)胞毒性的影響以DMSO溶劑組的細(xì)胞存活率為100%，溶劑加大鼠、犬和人肝微粒體組的細(xì)胞存活率分別為溶劑組的95.9%、96.8%和96.7%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無顯著性(P＞0.05)，表明肝微粒體對HK-2細(xì)胞的存活率沒有影響。

補(bǔ)骨脂酚組和補(bǔ)骨脂酚加各種屬肝微粒體組的HK-2細(xì)胞存活率見Tab 1。由表可見，補(bǔ)骨脂酚組在藥物濃度達(dá)到20 μmol·L-1后細(xì)胞存活率明顯下降，并在20～50 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系(Fig 2)。

與補(bǔ)骨脂酚組相比，加入大鼠、比格犬和人肝微粒體(P＜0.01)能提高20 ～50 μmol·L-1補(bǔ)骨脂酚組的細(xì)胞存活率，減低補(bǔ)骨脂酚對HK-2細(xì)胞的毒性，即使在最高的實(shí)驗(yàn)濃度(50 μmol·L-1)補(bǔ)骨脂酚也未表現(xiàn)出明顯的毒性(Fig 2)。所有的鼠和人肝微粒體組與對照組之間無差異(P＞0.05);而加入犬肝微粒體的 30、40、50 μmol·L-1補(bǔ)骨脂酚組細(xì)胞存活率均低于本組對照，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果表明，犬肝微粒體在同等蛋白濃度水平對補(bǔ)骨脂酚的減毒作用要低于人和大鼠肝微粒體。

2.3補(bǔ)骨脂酚在大鼠、比格犬和人肝微粒體中的代謝消除將補(bǔ)骨脂酚分別與3個(gè)種屬肝微粒體孵育，得到的代謝消除動(dòng)力學(xué)曲線見Fig 3。補(bǔ)骨脂酚在不加NADPH的孵育液中不發(fā)生代謝，表明其肝代謝是NADPH依賴的。補(bǔ)骨脂酚在3個(gè)種屬肝微粒體中均能較快地代謝消除，60 min后原藥濃度下降至50%以下，其中以大鼠肝微粒體的代謝最快，人肝微粒體的代謝最慢。補(bǔ)骨脂酚在大鼠肝微粒體0～30 min內(nèi)、在犬和人肝微粒體0～60 min內(nèi)呈線性消除，據(jù)此計(jì)算得到消除半衰期和內(nèi)在清除率CLint和肝清除率CLh，見Tab 2。大鼠和犬肝微粒體對補(bǔ)骨脂酚的代謝消除半衰期及清除率與人相比差異有顯著性(P＜0.01)。

Tab 1 Effects of bakuchiol with/without rat，dog and human liver microsomes on HK-2 cell survival after 4 h exposure(±s，n=5)

Tab 1 Effects of bakuchiol with/without rat，dog and human liver microsomes on HK-2 cell survival after 4 h exposure(±s，n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs bakuchiol group at the same concentration level;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs 0.5%DMSO+LM group for each species

Concentration/μmol·L-1 bakuchiol 0.5%DMSO 100.00±1.65 105.37±5.71 103.23±7.Cell viability/%bakuchiol RLM+bakuchiol BLM+bakuchiol HLM+29 103.36±1.57 0.5%DMSO+LM - 100.00±2.57 100.00±2.03 100.00±6.19 10 96.27±2.05 96.73±4.64 101.61±8.35 98.52±4.02 20 95.21±1.31 101.33±1.02* 98.16±0.43 99.20±3.86 30 71.35±4.27 96.50±5.56＊＊ 90.46±2.01＊＊# 101.46±2.05＊＊40 37.42±2.01 97.33±3.36＊＊ 93.32±2.59＊＊## 102.51±5.44＊＊50 18.94±2.10 97.05±7.22＊＊ 90.43±1.88＊＊## 102.15±1.61＊＊

Tab 2 In vitro liver microsomal metabolic parameters of bakuchiol and predicted hepatic clearances of three species(±s，n=3)

Tab 2 In vitro liver microsomal metabolic parameters of bakuchiol and predicted hepatic clearances of three species(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs human

LM Parameter T Km Vmax 12/min CLint/ml·min-1·kg-1 CLh/ml·min-1·kg-1/μmol·L-1/μmol·L-1·min -1 RLM 6.79±0.39＊＊ 365.92±20.01＊＊ 47.60±0.36＊＊ 31.89±2.60＊＊1.88±0.09 BLM 53.31±0.29＊＊ 65.16±0.35＊＊ 20.92±0.036＊＊ 89.35±4.32* 0.57±0.01 HLM 44.14±1.13 39.38±1.04 13.57±0.12 81.66±3.41 0.47±0.01＊＊

2.4補(bǔ)骨脂酚在大鼠、比格犬和人肝微粒體中的酶動(dòng)力學(xué)將不同濃度的補(bǔ)骨脂酚與3個(gè)種屬肝微粒體孵育，觀察到其代謝在32μmol·L-1的濃度以下不呈飽和，故選擇補(bǔ)骨脂酚濃度2、4、8、16和32 μmol·L-1與0.5 g·L-1的各微粒體蛋白共同孵育，測定補(bǔ)骨脂酚的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax值，結(jié)果見Tab 2。補(bǔ)骨脂酚與大鼠肝微粒體酶的表觀親和力最高(Km值最小)，人次之，比格犬為最弱;而最大反應(yīng)速度(Vm)的排序則是大鼠＞比格犬＞人。

Fig 3 In vitro metabolic kinetic of bakuchiol in liver microsomes of human，dog and rat

3 討論

前期的研究［10］發(fā)現(xiàn)，大鼠肝S9對補(bǔ)骨脂酚的HK-2細(xì)胞毒性有減低作用，但在藥物高濃度(40 μmol·L-1)仍表現(xiàn)出一定的腎細(xì)胞毒性。本研究用相同蛋白濃度的不同種屬肝微粒體與補(bǔ)骨脂酚共孵育，觀察到即使在50 μmol·L-1的高濃度，補(bǔ)骨脂酚對HK-2細(xì)胞也沒有明顯的腎細(xì)胞毒性。體外代謝試驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂酚在肝微粒體中能較快代謝消除，且是依賴于NADPH的，說明肝微粒體對補(bǔ)骨脂酚的代謝減毒作用是由微粒體細(xì)胞色素P450酶(CYP)介導(dǎo)的。本課題組對代謝酶表型的初步研究證實(shí)，CYP2C19、2C9和3A4等多個(gè) CYP酶亞型參與了補(bǔ)骨脂酚的肝代謝(未發(fā)表資料)，補(bǔ)骨脂酚經(jīng)CYP酶代謝后可能轉(zhuǎn)化成無毒或低毒的代謝產(chǎn)物。肝S9與微粒體同屬肝亞細(xì)胞成分，肝S9含有胞質(zhì)和微粒體酶，將S9進(jìn)一步超速離心可以得到主要含有CYP酶的肝微粒體。因此，在相同蛋白濃度水平微粒體中CYP酶的含量要高于S9，這可能是肝微粒體對高濃度補(bǔ)骨脂酚的減毒作用強(qiáng)于S9的主要原因。

補(bǔ)骨脂酚在大鼠、犬和人肝微粒體中均能較快地代謝消除，但其肝臟代謝消除速率和酶動(dòng)力學(xué)存在一定的種屬差異。補(bǔ)骨脂酚在大鼠肝微粒體的代謝最快，僅為6.79 min;外推得到的大鼠內(nèi)在清除率和肝臟清除率也明顯高于比格犬和人。補(bǔ)骨脂酚與大鼠微粒體酶的表觀親和力最高(Km值最小)其次是人，比格犬最弱;最大反應(yīng)速率Vmax則是大鼠＞比格犬＞人。

CYP同工酶在不同種屬肝臟中的組成和相對含量存在差異［14］;由于不同CYP同工酶能介導(dǎo)不同的代謝反應(yīng)，因而CYP酶介導(dǎo)的代謝反應(yīng)和生成的代謝產(chǎn)物種類或量也存在著種屬差異［13］。補(bǔ)骨脂酚在3個(gè)種屬肝微粒體中的代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的差異，很可能與不同種屬肝臟中與補(bǔ)骨脂酚代謝相關(guān)的CYP酶的分布及相對豐度的差異有關(guān)。在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中觀察到，犬肝微粒體對補(bǔ)骨脂酚細(xì)胞毒性的降低作用與人和大鼠相比有一定的差異，這一差異不僅與補(bǔ)骨脂酚在不同種屬肝微粒體的代謝動(dòng)力學(xué)的差異有關(guān)，也可能與犬肝中與補(bǔ)骨脂酚減毒相關(guān)藥酶的分布差異相關(guān)。補(bǔ)骨脂酚的轉(zhuǎn)化途徑和代謝動(dòng)力學(xué)的種屬差異以及對腎毒性的可能影響有必要在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

綜上所述，肝微粒體能明顯降低補(bǔ)骨脂酚的HK-2細(xì)胞毒性，并與肝臟CYP酶介導(dǎo)的代謝相關(guān)。補(bǔ)骨脂酚的肝代謝動(dòng)力學(xué)存在一定的種屬差異，大鼠與人有較大差異，而比格犬與人相對接近，但對高濃度補(bǔ)骨脂酚細(xì)胞毒性的降低作用犬和人之間存在一定的差異。因此，在補(bǔ)骨脂酚毒性實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物選擇以及將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推至人時(shí)應(yīng)考慮到人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間的種屬差異性。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版，一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:174.

［1］Chinese Pharmacopoeia Commission.Charmacopoeia Pharmacopoeia.2010，VolumeⅠ［S］.Beijing:Chinese Medicine Science and Technology Press，2010:174.

［2］Qiao C F，Han Q B，Song J Z，et al.Chemical fingerprint and quantitative analysis of fructus psoraleae by high-performance liquid chromatography［J］.J Sep Sci，2007，30(6):813-8.

［3］Backhouse C N，Delporte C L，Negrete R E，et al.Active constituents isolated from Psoralea glandulosa L.with antiinflammatory and antipyretic activities［J］.J Ethnopharmacol，2001，78(1):27-31.

［4］Katsura H，Tsukiyama R I，Suzuki A，Koloayashi M.In vitroantimicrobial activities of bakuchiol against oral microorganisms［J］.Antimicrob Agents Chemother，2001，45(11):3009-13.

［5］Zhao G，Zang S Y，Zheng X W，et al.Bakuchiol analogs inhibit monoamine transporters and regulate monoaminergic functions［J］.Biochem Pharmacol，2008，75(9):1835-47.

［6］陳紅莉，馮慧瑾，李援朝.補(bǔ)骨脂酚的體外抗腫瘤活性及其關(guān)鍵中間體的合成研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45(4):467-70.

［6］Chen H L，F(xiàn)eng H J，Li Y C.In vitroantitumor activity and synthesis of the key intermediate of bakuchiol［J］.Acta Pharm Sin，2010，45(4):467-70.

［7］Park E J，Zhao Y Z，Kim Y C，Sohn D H.Protective effect of(s)-bakuchiol from Psoralea corylifolia on rat liver injuryin vitroandin vivo［J］.Planta Med，2005，71(6):508-13.

［8］壽清耀，楊榮平，王賓豪，等.補(bǔ)骨脂雌激素樣作用的有效成分研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18(6):425-7.

［8］Shou Q Y，Yang R P，Wang B H，et al.Study on the effective constituents with estrogenic action in frusctus psoraleae［J］.Tradit Chin Drug Res Clin Pharmacol，2007，18(6):425-7.

［9］張玉順，劉玉琦，吳子倫，等.補(bǔ)骨脂酚對小鼠腎臟毒害作用的研究［J］.中國中藥雜志，1981(3):30-2.

［9］Zhang Y S，Liu Y Q，Wu Z L，et al.Study of bakuchiol induced toxical effect on mice's kidney［J］.Chin J Chin Mat Med，1981(3):30-2.

［10］江 芳，周昕睿，王 旗，張寶旭.補(bǔ)骨脂酚及其與補(bǔ)骨脂素合用對HK-2細(xì)胞的毒性及其機(jī)制［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2010，24(1):50-8.

［10］Jiang F，Zhou X R，Wang Q，Zhang B X.Cytotoxic effect and mechanism of bakuchiol and bakuchiol combined with psoralen on HK-2 cell［J］.Chin J Pharmacol Toxicol，2010，24(1):50-8.

［11］Yan D M，Chang Y X，Wang Y F，et al.In vivopharmacokinetics of bakuchiol after oral administration of bakuchiol extraction in rat plasma［J］.J Ethnopharmacol，2010，128(3):697-702.

［12］Obach R S.Nonspecific binding to microsomes:impact on scale-up ofin vitrointrinsic clearance to hepatic clearance as assessed through examination of warfarin，imipramine，and propranolol［J］.Drug Metab Dispos，1997，25(12):1359-69.

［13］莊笑梅，林慶輝，李春正，等.羅通定在人、比格犬和大鼠肝微粒體代謝轉(zhuǎn)化的體外比較研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(9):1147-52.

［13］Zhuang X M，Lin Q H，Li C Z，et al.In vitrocomparion of rotundine metabolism in liver microsomes of human，dog and rat［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(9):1147-52.

［14］程 婕，楊 凌.細(xì)胞色素P450氧化還原酶的研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(2):129-33.

［14］Cheng J，Yang L.Research progresses of cytochrome P450 reductase［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(2):129-33.