焦俊霞，高維娟，錢(qián) 濤，朱炎杰，董雅潔

(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北承德 067000)

黃芪是傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)氣生陽(yáng)、益氣固表、抗毒生肌之功能。另外，黃芪提取物黃芪注射液(每1 ml相當(dāng)于2 g生藥)主要成分為黃芪皂苷和黃芪多糖等，具有擴(kuò)張微細(xì)動(dòng)脈、改善微循環(huán)、增強(qiáng)心肌收縮力、降低血小板黏滯度和保護(hù)紅細(xì)胞變形能力等功能，臨床上多用于治療心、腦血管疾病。張雅麗等［1］黃芪注射液可以抑制缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，但其干預(yù)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元建立缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖模型來(lái)模擬腦缺血/再灌注病理生理過(guò)程，觀察黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元 cyt-c(cytochrome c)、CcO(cytochrome c oxidase)表達(dá)的影響，探討黃芪有效成分抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，新生1～2 d，♀♂兼有，SPF級(jí)動(dòng)物，由天津山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，許可證號(hào):SCXK(津)2009-001。

1.2試劑和儀器小鼠抗大鼠cyt-c單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于上海申能博彩生物公司;cyt-c引物是由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì);TRIzol購(gòu)自 Invitrogen公司，批號(hào):15596-026;RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，批號(hào):DRR019A;多聚賴氨酸、批號(hào)P2636、阿糖胞苷、批號(hào)C1468，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胎牛血清、馬血清由Hyclone公司生產(chǎn);谷氨酰胺、胰蛋白酶購(gòu)自華美生物工程公司;DMEM/F12培養(yǎng)基、B27由美國(guó)Gibco公司生產(chǎn);免疫組化染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司;黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字z51021776;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)取新生24 h的乳鼠放進(jìn)冰浴的體積分?jǐn)?shù)為75%酒精內(nèi)浸泡1 min消毒，用眼科顯微鑷夾取海馬組織，吸去上層D-Hanks液，放入與海馬組織體積10倍的0.125%胰蛋白酶消化10～15 min，同時(shí)用眼科剪剪切海馬組織到1 mm3大小，用馬血清終止消化，把組織塊混合液移入離心管，1 000 r·min-1離心5 min，離心3 次，去上清后加入DMEM/F12溶液5 ml，用吹打管反復(fù)吹打70次制成細(xì)胞懸液，以200目濾網(wǎng)過(guò)濾。取10 μl細(xì)胞懸液臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)，接種到培養(yǎng)瓶(皿)。

1.4缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細(xì)胞模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組把原代培養(yǎng)8 d的大鼠海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組、模型組、黃芪注射液組和黃芪注射液溶劑對(duì)照組。除正常對(duì)照組外均參照Bossenmeyer等［2］的方法建立缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細(xì)胞模型:用無(wú)糖Earle's液代替正常培養(yǎng)液，隨即把培養(yǎng)皿(瓶)置于37℃溫箱中的缺氧裝置里，快速通入高純氮?dú)? min，再使氣體勻速緩慢連續(xù)排出。缺氧缺糖30 min后，換正常無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。正常對(duì)照組正常培養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理;黃芪注射液組于缺氧缺糖時(shí)加入黃芪注射液［0.5 g(生藥)·L-1］［1］，直至培養(yǎng)結(jié)束;黃芪注射液溶劑對(duì)照組處理方法與黃芪注射液組相同，只是將黃芪注射液換為pH值7.4的等量黃芪注射液溶劑即無(wú)菌去離子水;模型組在缺氧缺糖時(shí)加入與正常培養(yǎng)液等量的Earle's液，缺氧缺糖后正常培養(yǎng)。各組在復(fù)氧復(fù)糖后0、0.5、2、6、24、72 和 120 h 檢測(cè) cyt-c、CcO 的表達(dá)。

1.5免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)海馬神經(jīng)元NSE及cyt-c表達(dá)采用SP法檢測(cè)cyt-c，具體操作均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。兔抗大鼠NSE多克隆抗體按1∶50稀釋，小鼠抗大鼠cyt-c單克隆抗體按1∶400稀釋;PBS代替一抗作陰性對(duì)照。陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)和突起呈棕黃色，胞核有少許黃色顆粒。陽(yáng)性性表達(dá)方法:高倍鏡下計(jì)算5個(gè)非連續(xù)視野陽(yáng)性表達(dá)面積之和與5個(gè)視野面積之和的平均比值。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.6蛋白免疫印跡法檢測(cè)海馬神經(jīng)元cyt-c蛋白的表達(dá)收集細(xì)胞，提取胞質(zhì)蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取30 μg樣品，以15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，0.5%脫脂奶粉封閉2 h，小鼠抗大鼠cyt-c單克隆抗體(1∶300稀釋)，4℃過(guò)夜。用山羊抗小鼠鼠的二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，洗膜液洗后用ECL發(fā)光液顯色，X射線底片曝光。以βactin為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。用凝膠分析軟件Quantity one進(jìn)行定量分析。

1.7RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CcO mRNA的表達(dá)收集細(xì)胞，用TRIzol一步法提取RNA，按TaKaRa RNA PCR kit(AMV)說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。內(nèi)參照β-actin 上游引物 5'-CATCCTGCGTCTGGACCT-3'，下游引物5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為480 bp。擴(kuò)增條件:94℃ 2 min;94℃ 30 s;58℃ 30 s;72℃ 4 min，循環(huán)35次。CcO上游引物5'-GGCAGAATGTTGGCTACCAGG-3'，下游引物 5'-GCCCACCACTGTCTTCCACTCAT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為321 bp。擴(kuò)增條件:95℃ 2 min;94℃ 30 s;57℃30 s;72℃ 4 min，最后于72℃延伸3 min，循環(huán)35次。用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。用凝膠分析軟件Quantity one進(jìn)行定量分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xˉ±s表示，用SPSS 13.0軟件進(jìn)行多因素方差分析，方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Games-Howell檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)純度鑒定免疫組化染色結(jié)果顯示:無(wú)血清培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)元胞體飽滿，突起明顯、突起末端分支形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，相互支持生長(zhǎng)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞少見(jiàn)，5個(gè)400倍視野中陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目為72個(gè)，純度為(91.48±0.72)%，見(jiàn) Fig 1。

Fig 1 The expression of NSE protein

2.2細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)海馬神經(jīng)元cyt-c蛋白表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比，模型組除0 h外其余各時(shí)間點(diǎn)cyt-c蛋白表達(dá)明顯增高(P＜0.05);與模型組比，黃芪注射液組除0 h外其余各時(shí)間點(diǎn)cyt-c蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)，而黃芪注射液溶劑對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，見(jiàn)Fig 2、3。

2.3黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元cyt-c蛋白表達(dá)的影響Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:cyt-c蛋白表達(dá)趨勢(shì)與細(xì)胞免疫化學(xué)表達(dá)一致，見(jiàn) Fig 4、5。

2.4黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元CcO mRNA表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示:CcO mRNA同cyt-c蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致，見(jiàn)Fig 6、7。

3 討論

腦血管病是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)病、多發(fā)病、其致死率、致殘率均較高，缺血造成了腦組織的損傷，再灌注更使可逆性缺血損傷加重，并通過(guò)各種反應(yīng)將可逆性損傷轉(zhuǎn)化為不可逆性損傷。研究表明，線粒體在真核細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著樞紐作用，線粒體通路在神經(jīng)細(xì)胞凋亡控制中發(fā)揮決定性作用［3］。

線粒體在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起最基本的作用，其關(guān)鍵性分子是cyt-c，而主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中JNK3的表達(dá)與神經(jīng)元凋亡關(guān)系十分密切，葉冬青［4］等研究表明，缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖可通過(guò)增加JNK3表達(dá)而誘發(fā)神經(jīng)元凋亡。在鈣離子超載、氧自由基等應(yīng)激刺激下，細(xì)胞通過(guò)MAPK(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)、MKK4(Mitogen-activated protein kinase kinase-4，MKK4)和MKK7(mitogen-activated protein kinase kinase7，MKK7)，使 JNK(c-Jun N terminal kinase，JNK)和p38三肽區(qū)的蘇氨酸/酪氨酸雙磷酸化而激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［5］，表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)的JNK3被磷酸化而激活后逐漸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，使高電導(dǎo)非選擇性通道PTP(permeability transition pore，PTP)開(kāi)放和線粒體膜電位崩解［6］，水分進(jìn)入導(dǎo)致線粒體外膜斷裂cyt-c和AIF(apoptotic inducing factor)釋放入胞質(zhì)。進(jìn)入胞質(zhì)的cyt-c與凋亡酶激活因子-1(apoptotic protease activating factors-1，APAF-1)結(jié)合并將其激活，然后又結(jié)合輔助因子dATP/ATPAPA構(gòu)成凋亡小體，其中的APAF-1招募procaspase-9在凋亡小體上寡聚［7］，procaspase-9發(fā)生同源活化，其進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)胱天蛋白酶caspase-3，進(jìn)而活化caspase-6、7使細(xì)胞走向凋亡［8］。他們通過(guò)激活一系列下游基因發(fā)揮調(diào)節(jié)凋亡作用。

Fig 2 The effect of astragalus injection on expression of cyt-c protein after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats(×400，n=5)

Fig 3 The effect of astragalus injection on mean optic density of cyt-c protein after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats(±s，n=5)

Fig 4 The effect of astragalus injection on expression of cyt-c protein after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats

Fig 5 The effect of astragalus injection on mean optic density of cyt-c protein after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats(±s，n=5)

Fig 6 The effect of astragalus injection on expression of CcO mRNA after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats

Fig 7 The effect of astragalus injection on mean optic density of CcO mRNA after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats(±s，n=5)

此外，線粒體是有氧呼吸產(chǎn)生能量的主要場(chǎng)所，cyt-c與CcO均是呼吸鏈的電子傳遞體，其中CcO是呼吸鏈末端的限速酶，定位于線粒體表面參與線粒體的呼吸氧化作用，在細(xì)胞凋亡中起極其重要的作用。在缺血缺氧時(shí)，線粒體膜通透性增加，大量CcO釋放入細(xì)胞胞質(zhì)，阻斷呼吸鏈電子傳遞，細(xì)胞能量供應(yīng)減少，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。李慢等［9］，電鏡酶細(xì)胞化學(xué)法顯示創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元線粒體CcO大量釋放入胞質(zhì)，RT-PCR方法表明在凋亡高峰出現(xiàn)前CcO的釋放達(dá)到最多。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪所含的黃芪皂苷類和黃芪多糖具有擴(kuò)張血管、清除體內(nèi)氧自由基、減少血栓形成、改善腦血流、降低血脂、改善微循環(huán)等多重作用［10］。黃芪注射液為中藥黃芪提取物制成的針劑，具有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、通脈養(yǎng)心、健脾利濕的作用。黃芪注射液每1 ml相當(dāng)于生藥2 g，張雅麗等［1］研究證實(shí)黃芪注射液可提高細(xì)胞的活性，抑制缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

本實(shí)驗(yàn)以大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞施加缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖因素來(lái)模擬腦缺血/再灌注病理生理過(guò)程，海馬神經(jīng)元在缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖0 h細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路未啟動(dòng)，故各組cyt-c蛋白及CcO mRNA表達(dá)比較無(wú)明顯差異。復(fù)氧復(fù)糖0.5 hcyt-c隨細(xì)胞凋亡信號(hào)的啟動(dòng)而開(kāi)始升高，CcO釋放入胞質(zhì)。隨著復(fù)氧復(fù)糖時(shí)間延長(zhǎng)，進(jìn)一步發(fā)揮凋亡信號(hào)傳遞過(guò)程，模型組cyt-c蛋白及CcO mRNA表達(dá)進(jìn)一步增高6 h達(dá)高峰，復(fù)氧復(fù)糖24、72、120 h表達(dá)逐漸降低但仍高于正常組。黃芪有效成分可降低缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后除0 h外各時(shí)間點(diǎn)cyt-c、CcO的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)研究表明黃芪有效成分可通過(guò)抑制CcO mRNA及cyt-c蛋白的表達(dá)，提高線粒體CcO活性，從而抑制CcO釋放入胞質(zhì)，發(fā)揮抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。

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