張付利，厲永強，史 齊，李延紅，皇甫超申

(河南大學醫(yī)學院環(huán)境醫(yī)學研究所，河南開封 475004)

亞硝酸鈉是一種常見的亞硝酸鹽，廣泛存在于自然界水體、蔬菜中，在食品加工過程中常用作添加劑防腐和增加風味，同時也廣泛用于工業(yè)防腐和醫(yī)藥領域，因此廣受人們關注。亞硝酸鹽有可能與人體二級胺反應形成亞硝胺類物質(zhì)，通常被認為有致癌作用。流行病學研究表明攝入過多的亞硝酸鹽有導致消化道癌發(fā)生和致畸的危險，由于一直缺乏有力的實驗支持，目前并不清楚亞硝酸鹽對癌細胞的確切作用［1］。最近發(fā)現(xiàn)，人體亞硝酸鹽不僅來自外源性飲水和食物，也可以由一氧化氮氧化內(nèi)源性產(chǎn)生。亞硝酸鹽在人體缺氧或酸性環(huán)境下，可以還原為一氧化氮，因此，維持人體一定劑量的亞硝酸鹽可以調(diào)節(jié)生理機能，減輕心血管病的危害［2］。在這種背景下，研究亞硝酸鹽對癌細胞生物作用就顯得尤為迫切。課題組前期發(fā)現(xiàn)［3］，亞硝酸鈉對人肝癌細胞SMMC-7721增殖具有雙相劑量效應，但機制不清，為此，課題組對亞硝酸鈉誘導的人肝癌細胞SMMC-7721增殖、凋亡相關的早期增殖基因和缺氧誘導因子表達做了進一步研究。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器

1.1.1主要試劑 亞硝酸鈉(NaNO2)，天津市晨?；瘜W試劑廠(分析純);DMEM培養(yǎng)基(Gibco，with high glucose);新生牛血清，杭州四季青生物公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO)，噻唑蘭(MTT)，Hochest33258購自Sigma公司;TRIzol試劑(美國 Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)，Taq酶(美國MBI公司)，其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。c-myc引物由上海生工合成。HIF-1α單克隆抗體購自碧云天生物有限公司，鼠抗雞囊(C4)βactin單抗、ECL Western blot化學發(fā)光檢測試劑盒均購自Santa Cruz公司。

1.1.2主要儀器 MK3型酶標儀(Labsystem，Helsink，芬蘭)，F(xiàn)ACSSalibur流式細胞儀(BD，美國);BX51熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本);UV-540紫外-可見分光光度計(UNICAM，美國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 肝癌細胞系SMMC-7721購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所。細胞生長在含100 ml·L-1胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基中，置5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2MTT細胞增殖分析 SMMC-7721細胞于5%CO237℃恒溫培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用胰酶和EDTA消化，調(diào)整細胞數(shù)為1×1010cells·L-1接種到96孔細胞培養(yǎng)板，0.2 ml/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換液，分別用含不同濃度亞硝酸鈉的DMEM培養(yǎng)液處理細胞(每個濃度5個復孔)，對照組只加培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h，每孔加入5 g·L-1MTT 20 μl培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO于振蕩器上振搖，待蘭色晶體完全溶解后，在酶標儀上測定570 nm處的吸光度值(A值)并計算生長率。以含有等體積的培養(yǎng)液和DMSO的無細胞孔測得的吸光度值為空白對照，實驗重復3次。

1.2.3RT-PCR法檢測SMMC-7721細胞c-myc mRNA的表達 將SMMC-7721細胞種植于50 ml培養(yǎng)瓶中生長至亞融合狀態(tài)后，在含1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，然后加入不同濃度的亞硝酸鈉作用24 h后收集細胞，采用異硫氰酸胍-酸性酚-氯仿抽提法提取總RNA，以β-actin為內(nèi)參照，按RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增。c-myc上游引物:5'-CAAGAGGCGAACACACAACGT CT-3'，下游引物:5'-AACTGTTCTCGTCGTTTCCGC-3'，擴增產(chǎn)物為 219 bp。β-actin上游引物:5'-GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3'，下 游 引 物:5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTTTT-3'，擴增產(chǎn)物為516 bp。反應條件:94℃ 變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃延伸60 s，共進行30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 mg·L-1溴乙錠)，膠片經(jīng)光密度掃描，測定各條帶吸光度值，以β-actin作內(nèi)參照，計算相對比值。

1.2.4Hoechst 33258單染分析細胞增殖分數(shù) 細胞以5×107cell·L-1濃度接種培養(yǎng)于預置蓋玻片(用0.1 g·L-1多聚賴氨酸處理)的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接種細胞數(shù)為1.5×105個。在不同時間點取出細胞爬片，經(jīng)4%多聚甲醛固定、PBS沖洗、hoechst33258染色，紫外光激發(fā)，OLYMPUS-BX51熒光顯微鏡觀察。實驗重復3次，每張爬片隨機選5個視野，計數(shù)正常有絲分裂細胞占總細胞比例為細胞相對增殖分數(shù)。

1.2.5流式細胞術測定細胞凋亡 采用FITC-annexinⅤ/PI雙染法，分別收集各組細胞到10 ml的離心管中，每樣本細胞數(shù)為1×109·L-1，1 000×g離心5 min，棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗滌1次，1 000×g離心5 min，用100 μl的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育15 min，1 000×g離心5 min，沉淀細胞孵育緩沖液洗1次。加入annexinⅤ-FITC/PI溶液 5 μl 4℃下孵育 20 min，最后補 PBS 400 μl，以流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。每個樣品檢測1萬個細胞，用cellquest軟件進行細胞凋亡分析。

1.2.6Western blot檢測HIF-1α蛋白表達 細胞于對數(shù)生長期加入各種濃度的亞硝酸鈉，作用24 h后用RIPA 200 μl充分裂解提取蛋白，考馬斯亮藍G-250法測樣品蛋白濃度，均衡每組蛋白濃度后，以12%SDS-PAGE凝膠電泳分離電轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入各種一抗(1∶200)于4℃封閉袋中孵育過夜，二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體，1∶4 000)孵育1 h?；瘜W發(fā)光法顯示結(jié)果，壓片曝光，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，檢測蛋白質(zhì)印跡條帶。

1.2.7統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)均采用±s表示，應用SPSS 12.0軟件包處理，經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性檢驗后，進行單因素方差分析及兩兩比較t檢驗。

2 結(jié)果

2.1亞硝酸鈉對人肝癌細胞SMMC-7721增殖的影響MTT分析結(jié)果顯示，亞硝酸鈉對人肝癌細胞SMMC-7721增殖作用呈雙相劑量效應關系曲線(Fig 1)，低劑量刺激增殖，高劑量抑制增殖，最明顯的刺激細胞增殖作用出現(xiàn)在第24 h，最大促增殖效應為對照組的156%，IC50值為3 400 mg·L-1。

Fig 1 Cell proliferation in SMMC-7721 cells treated with sodium nitrite for 12，24，36，48 h(±s，n=3)

2.2亞硝酸鈉對人肝癌細胞SMMC-7721 c-myc mRNA表達的影響根據(jù)MTT實驗結(jié)果，從上述處理細胞的亞硝酸鈉濃度范圍內(nèi)選取4個劑量，處理SMMC-7721細胞24 h，由 Fig 2可見，20、200 mg·L-1亞硝酸鈉處理組細胞c-myc mRNA表達量明顯高于空白對照組(P＜0.05)，而800和3 400 mg·L-1亞硝酸鈉處理組細胞c-myc mRNA表達量與空白對照組差別無顯著性(P＞0.05)。

Fig 2 Expression of c-myc mRNA in SMMC-7721 cells treated with sodium nitrite for 24 h(±s，n=3)

2.3亞硝酸鈉對SMMC-7721細胞分裂指數(shù)和凋亡的影響用Hoechst 33258熒光染料對細胞染色質(zhì)染色，熒光顯微鏡下可分辨分裂期細胞。用200 mg·L-1亞硝酸鈉作用SMMC-7721細胞24 h，細胞分裂指數(shù)為(6.88±1.2)%，與對照組(2.65±0.56)%相比，差異具有顯著性(P＜0.05)。800 mg·L-1亞硝酸鈉作用細胞24 h，細胞分裂指數(shù)為(2.76±1.1)%，比對照組略增高，但差異無顯著性(P＞0.05)，3 400 mg·L-1亞硝酸鈉作用24 h，細胞分裂幾乎被完全抑制，細胞分裂指數(shù)為(0.98±0.12)%，用實驗組細胞分裂指數(shù)與對照組分裂指數(shù)相比，得出細胞相對分裂指數(shù)制成柱狀圖見Fig 3C。流式細胞術分析結(jié)果見Fig 3F，200 mg·L-1亞硝酸鈉作用細胞24 h，細胞凋亡率為(3.54±2.93)%(Fig 3B)，對照組細胞凋亡率為(5.98±2.16)%(Fig 3A)，經(jīng)t檢驗，差異具有顯著性(P＜0.05);800 mg·L-1亞硝酸鈉作用24 h，細胞凋亡率為(6.55±3.12)%(Fig 3D)，比對照組高，但差異無顯著性(P＞0.05);3 400 mg·L-1亞硝酸鈉作用細胞24 h，細胞凋亡率為(53.54±4.62)%(Fig 3E)，與對照組相比明顯升高(P＜0.05)。

Fig 3Mitotic and apoptosis efficiency in SMMC-7721 cells treated with sodium nitrite(±s，n=3)

2.4亞硝酸鈉對人肝癌細胞SMMC-7721 HIF-1α蛋白表達的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)的對照組SMMC-7721細胞有少量HIF-1α蛋白表達，亞硝酸鈉終濃度在20～800 mg·L-1范圍作用24 h，與空白對照組相比，細胞HIF-1α蛋白表達明顯增加(P＜0.05)，而亞硝酸鈉終濃度在3 400 mg·L-1時，細胞HIF-1α蛋白表達量有所下降，但與空白對照組相比差異無顯著性(P＞0.05)。見Fig 4。

Fig 4 Protein expression of HIF-1α in SMMC-7721 cells treated with sodium nitrite for 24 h(±s，n=3)

3 討論

MTT實驗發(fā)現(xiàn)，用終濃度20～200 mg·L-1范圍內(nèi)亞硝酸鈉處理人肝癌SMMC-7721細胞24 h，可明顯促進細胞增殖，隨著時間延長，促增殖作用有所減弱，但皆可維持48 h。用200 mg·L-1亞硝酸鈉處理細胞24 h，細胞分裂指數(shù)增加，細胞早期增殖基因c-myc mRNA表達增加，結(jié)果表明，亞硝酸鈉在一定劑量下，對SMMC-7721細胞有促進增殖作用。

低劑量亞硝酸鈉促進細胞增殖作用可能與下列機制有關:①在培養(yǎng)體系內(nèi)產(chǎn)生少量一氧化氮:一般認為，亞硝酸鈉在低劑量時是一種還原劑，在酸性或缺氧條件下，細胞利用酶或非酶途徑將亞硝酸鹽還原為NO［4］，低劑量的NO或低劑量亞硝酸根離子本身都是信號分子，具有刺激細胞增殖的效應［5］。本實驗是在普通培養(yǎng)條件下進行的，細胞培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液pH值從7.3降至6.3左右，因此培養(yǎng)體系有可能產(chǎn)生少量一氧化氮。②刺激細胞分泌細胞因子:自分泌或旁分泌細胞因子是癌細胞的基本特征，借此無需外源性生長因子也能維持其自身生長和惡性表型轉(zhuǎn)化。有報道，亞硝酸鈉通過刺激胃癌細胞分泌 TNF、IL-6、IL-8發(fā)揮促進細胞增殖作用［6］，據(jù)此推測，亞硝酸鈉可能會促進 SMMC-7721細胞分泌細胞因子，促進細胞增殖。③增加細胞有氧糖酵解:低劑量亞硝酸鹽刺激細胞增殖的作用，與亞硝酸鹽及其還原的NO與線粒體呼吸鏈Ⅰ及Ⅳ結(jié)合，阻滯了呼吸鏈電子傳遞［7］，減少細胞內(nèi)氧消費，細胞轉(zhuǎn)而采用糖酵解方式獲取能量［8］。本實驗發(fā)現(xiàn)低劑量亞硝酸鈉誘導c-myc mRNA表達增加，而c-myc能促進糖酵解通路上許多酶活性增加，促進細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運，增加糖酵解，促進細胞增殖［9］。④促進細胞缺氧誘導因子表達:HIF-1是腫瘤細胞適應缺氧而產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與哺乳動物細胞中缺氧誘導產(chǎn)生的特異應答，在缺氧誘導的基因表達調(diào)節(jié)中起著關鍵作用。腫瘤中HIF-1上調(diào)糖轉(zhuǎn)運和糖酵解酶的相關基因，誘導血管生成因子表達增加，刺激細胞增殖。HIF-1除受缺氧調(diào)控以外，其他非氧依賴因素，如激素、生長因子、細胞因子、一氧化氮皆可調(diào)控其表達［10］。本實驗結(jié)果顯示，亞硝酸鈉在一定劑量范圍內(nèi)可以促進SMMC-7721細胞HIF-1α蛋白的表達，提示低劑量亞硝酸鈉促進細胞增殖與其增加細胞HIF-1α蛋白的表達有關。

本次實驗還發(fā)現(xiàn)，200 mg·L-1亞硝酸鈉作用細胞24 h，細胞凋亡率比空白對照組還要低，這可能與低劑量亞硝酸鹽抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ，減少活性氧產(chǎn)生有關［11］。

本實驗一個重要發(fā)現(xiàn)就是低劑量亞硝酸鈉促進細胞早期增殖基因c-myc和HIF-1α表達，有關這方面的研究目前尚未見報道。在生理情況下，HIF-1抑制c-myc的活性，但是在腫瘤缺氧微環(huán)境，HIF-1協(xié)同c-myc共同促進下游有關細胞增殖、能量代謝等相關基因的轉(zhuǎn)錄［12］。課題組認為，c-myc和HIF-1α協(xié)同參與了亞硝酸鈉促進細胞增殖作用，因為兩者都是細胞核轉(zhuǎn)錄因子，通常情況下以c-myc和HIF-1α復合體的形式協(xié)同作用，促進下游一系列與細胞增殖有關的基因表達，如血管生成因子和糖酵解有關的酶，而后兩者皆可促進細胞增殖［13］。

當亞硝酸鈉濃度超過800 mg·L-1時，呈現(xiàn)濃度依賴性的細胞增殖抑制效應。用3 400 mg·L-1(24 h時的IC50值)亞硝酸鈉處理SMMC-7721細胞24 h，大量細胞凋亡或壞死，說明亞硝酸鈉在高劑量時作為一種氧化劑，大量破壞細胞膜結(jié)構(gòu)和染色質(zhì)的完整性，由此導致細胞死亡，這種細胞死亡與細胞內(nèi)大量產(chǎn)生活性氧有關［14］。本實驗還顯示，由于高劑量亞硝酸鈉導致細胞表達的c-myc mRNA和HIF-1α蛋白量與低劑量組相比有所下降，SMMC-7721細胞大量死亡，這從另外一個方面提示c-myc和HIF-1α參與了細胞增殖。

綜上所述，亞硝酸鈉對人肝癌SMMC-7721細胞呈現(xiàn)低劑量促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，高劑量抑制細胞增殖，促進細胞凋亡的雙相劑量效應關系;早期增殖基因c-myc和缺氧誘導因子表達增加在低劑量亞硝酸鈉促進SMMC-7721細胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。

［1］Hord N G，Tang Y，Bryan N S.Food sources of nitrates and nitrites:the physiologic context for potential health benefits［J］.Am J Clin Nutr，2009，90(1):1-10.

［2］Lundberg J O，Gladwin M T，Ahluwalia A，et al Nitrate and nitrite in biology，nutrition and therapeutics［J］.Nat Chem Biol，2009，5(12):865-9.

［3］孫玉生，史 齊，李延紅，等.低濃度亞硝酸鈉對人肝癌SMMC-7721細胞的毒物興奮性效應［J］.中國藥理學通報，2010，26(3):419-20.

［3］Sun Y S，Shi Q，Li Y H，et al.Characterization of low dose sodium nitrite induced hormesis-like effects in human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(3):419-20.

［4］Duranski M R，Greer J J，Dejam A，et al.Cytoprotective effects of nitrite during in vivo ischemia-reperfusion of the heart and liver［J］.J Clin Invest，2005，115(5):1232-40.

［5］Bryan N S，F(xiàn)ernandez B O，Bauer S M，et al.Nitrite is a signaling molecule and regulator of gene expression in mammalian tissues［J］.Nat Chem Biol，2005，1(5):290-7.

［6］Sun J，Aoki K，Wang W，et al.Sodium nitrite-induced cytotoxicity in cultured human gastric epithelial cells［J］.Toxicol In Vitro，2006，20(7):1133-8.

［7］Raat N J，Noguchi A C，Liu V B，et al.Dietary nitrate and nitrite modulate blood and organ nitrite and the cellular ischemic stress response［J］.Free Radic Biol Med，2009，47(5):510-7.

［8］Jensen F B.Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish［J］.J Exp Biol，2007，210(19):3387-94.

［9］Dang C V，Le A，Gao P.MYC-induced cancer cell energy metabolism and therapeutic opportunities［J］.Clin Cancer Res，2009，15(21):6479-83.

［10］Kim J W ，Gao P ，Liu Y C，et al.Hypoxia-inducible factor 1 and dysregulated c-Myccooperativelyinduce vascularendothelial growth factor and metabolic switches hexokinase and pyruvate dehydrogenase kinase 1［J］.Mol Cell Biol，2007，27(21):7381-93.

［11］Shiva S.Mitochondria as metabolizers and targets of nitrite［J］.Nitric Oxide，2010，22(2):64-74.

［12］Podar K，Anderson K C.A therapeutic role for targeting c-Myc/Hif-1-dependent signaling pathways［J］.Cell Cycle，2010，9(9):1722-8.

［13］Zhang J，Sattler M，Tonon G，et al.Targeting angiogenesis via a c-Myc/hypoxia-inducible factor-1alpha-dependent pathway in multiple myeloma［J］.Cancer Res，2009，69(12):5082-90.

［14］Erkekoˇglu P，Baydar T.Effect of allyl isothiocyanate(AITC)in both nitrite-and nitrosamine-induced cell death，production of reactive oxygen species，and DNA damage by the single-cell gel electrophoresis(SCGE):does it have any protective effect on HepG2 cells［J］?.Int J Toxicol，2010，29(3):305-12.