魏麗麗，陳 虹，姜 勇，屠鵬飛，鐘 明，杜 娟，劉 斐，劉春陽，王 磊

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，教育部新疆特種植物藥重點實驗室，新疆石河子 832002;2.北京大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，北京 100083)

松果菊苷(echinacoside，ECH)是從新疆特色植物藥管花肉蓯蓉中分離、純化的一種苯乙醇苷類有效成分。研究表明，ECH具有抗氧化［1-2］、保護(hù)神經(jīng)［3-4］、抗衰老［5］、改善學(xué)習(xí)記憶［6-8］等神經(jīng)保護(hù)作用。陳虹等的研究結(jié)果證實，ECH對帕金森病的DA能神經(jīng)元具有保護(hù)作用［9］。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是一類調(diào)節(jié)機體生理活動的重要物質(zhì)，組織中的含量能反映神經(jīng)遞質(zhì)生物合成、釋放、攝取、失活等過程［10-11］。目前關(guān)于ECH對腦缺血大鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)的影響尚未見相關(guān)報道。本研究運用腦微透析技術(shù)，考察了ECH對腦缺血大鼠紋狀體細(xì)胞外液中各單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響，初步探討了ECH對腦神經(jīng)保護(hù)的可能機制。

1 材料

1.1實驗動物SD大鼠，♂，體質(zhì)量250～300 g(購于新疆實驗動物中心，許可證編號:2009-0053)。

1.2藥品和試劑ECH由北京大學(xué)藥學(xué)院屠鵬飛教授惠贈(純度95%以上);去甲腎上腺素(NE)、多巴胺 (DA)、5-羥色胺 (5-HT)、3，4-二羥苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5-羥吲哚乙酸(HIAA)均為Sigma公司;注射用鹽酸川芎嗪(CXQ，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司);磷酸鋅水門汀(上海醫(yī)療器械股份有限公司產(chǎn)品，由液體和粉劑組成，用時調(diào)和);1-烷基硫酸鈉(DIKMA公司);水合檸檬酸(天津市津科精細(xì)化工研究所);檸檬酸三鈉(Acros公司);乙二胺四乙酸二鈉(J T Baker Chemical co);甲醇(DIKMA公司);乙腈(DIKMA公司);腦微透析灌流液為復(fù)方氯化鈉注射液(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司);所用水均為重蒸水。

1.3儀器美國BAS4100型大鼠腦立體定位儀;CMA/12探針及探針套管;CMA/120清醒動物裝置;CMA/402微量泵;CMA/150低溫樣品自動收集器。Esa公司5600A型輸液泵;Esa公司5600A型輸液泵;Esa公司542型自動進(jìn)樣裝置;Esa公司CoulArray電化學(xué)檢測器;玻璃碳工作電極和Ag/AgCl參考電極;C18色譜柱(DIKMA 公司，ODS 5 μm，150 mm×4.6 mm);CoulArray win色譜工作站(Esa公司);漩渦混旋器(QL-861型);臺式酸度測定儀(HANNA-211型);臺式高速離心機(XYJ-2型)。

2 方法

2.1動物分組及給藥大鼠30只，隨機分為5組:① 對照組(Control):生理鹽水1 ml·kg-1·d-1;②模型組(Model):生理鹽水1 ml·kg-1·d-1;③ 模型+川芎嗪(CXQ)30 mg·kg-1·d-1;④～⑤ 模型+ECH 高、低劑量組(ECHB，ECHS):30、15 mg·kg-1·d-1;各組動物均腹腔注射給藥7 d。

2.2造模方法和微透析每只大鼠均于給藥第3天埋置套管:將大鼠用10%水合氯醛(3.5 ml·kg-1)麻醉，固定于BAS 4100腦立體定位儀，參照George Paxinos《大鼠腦立體定位圖譜》將探針導(dǎo)管植入左側(cè)紋狀體(坐標(biāo)AP:+0.2 mm;ML:-3.0 mm;DV:-3.5 mm)，末次給藥1 h后麻醉，采用楊贊章［12］改進(jìn)Longa線拴法制作大鼠大腦局灶型腦缺血模型(MCAO模型)。對照組魚線僅插入10 mm，其余步驟同手術(shù)組。造模后在清醒自由活動狀態(tài)下插入微透析探針，用Ringer液以1.5 μl·min-1的速度灌流，4℃下收集腦微透析液，20 min收集1管透析液。每管透析液收集完畢后均立即置于-20℃冰箱保存，并在透析結(jié)束后轉(zhuǎn)存-70℃冰箱，擇日測定。探針在使用前做回收率測定，用于折算透析液中各單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的濃度。

2.3HPLC-ECD分析流動相配置:測定流動相每升含0.15 mol·L-1檸檬酸 -檸檬酸鈉緩沖液829 ml;0.1 mol·L-1乙二胺四乙酸二鈉1 ml;甲醇150 ml;1-烷基硫酸鈉0.283 g。設(shè)定流動相流速為0.7 ml·min-1，柱溫箱溫度為28℃。電化學(xué)檢測器工作電壓為:200 mV、400 mV、600 mV，分別為 2、3、4通道;增益為2 nA。進(jìn)樣量為25 μl。標(biāo)準(zhǔn)曲線用0.025、0.05、0.1、0.2、0.5 mg·L-1的梯度含混合標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制。

2.4統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件做重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。

3 結(jié)果

Fig 1～6描繪了大鼠紋狀體細(xì)胞外液中NE、DA、DOPAC、HIAA、HVA和5-HT水平的變化情況。從圖中可以看出，腦缺血后，紋狀體細(xì)胞外液單胺類神經(jīng)遞質(zhì)存在代謝紊亂，各遞質(zhì)含量均有所升高，在一定范圍內(nèi)，隨缺血時間的延長而升高的更加明顯。在缺血90 min時，紋狀體細(xì)胞外液DA、NE濃度可達(dá)對照組水平的3倍之多。對照組的 NE、DA、DOPAC、HIAA、HVA和5-HT水平由高漸低，其原因可能與結(jié)扎其左側(cè)頸總動脈后，左腦暫時性缺血及插入探針時產(chǎn)生的損傷有關(guān)。從變化的曲線上看，ECH與 CXQ均可降低腦缺血后 DA、DOPAC、HIAA、HVA和5-HT的達(dá)峰濃度，CXQ與高劑量的ECH較為明顯。各遞質(zhì)時程曲線下移說明ECH可抑制腦缺血大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的升高。

Fig 1 Effect of ECH on extracellular level of NE in striatum of rats

Fig 2 Effect of ECH on extracellular level of DA in striatum of rats

4 討論

腦缺血引起的腦損傷機制較為復(fù)雜。在腦缺血情況下，腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生紊亂，NE、DA、5-HT含量明顯降低，腦缺血越重，腦組織NE、DA、5-HT含量就越低［13］。而腦內(nèi)微透析法證明，腦缺血時單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量在細(xì)胞外液中升高，持續(xù)整個缺血期，且隨著缺血時間延長而進(jìn)一步上升，實驗結(jié)果與報道一致［14］。ECH是從新疆特色植物藥管花肉蓯蓉中分離、純化的一種苯乙醇苷類有效成分。其具有抗衰老、改善學(xué)習(xí)記憶、抗神經(jīng)元凋亡等多種神經(jīng)保護(hù)作用。本研究采用國內(nèi)較先進(jìn)的腦微透析聯(lián)用HPLC-ECD檢測技術(shù)，初步探討ECH對各腦缺血實驗大鼠紋狀體細(xì)胞外液中單胺類遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的影響，結(jié)果表明，ECH可降低由腦缺血所致的紋狀體細(xì)胞外液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的升高作用，具有較好的改善腦缺血組織的損傷作用。

Fig 3 Effect of ECH on extracellular level of DOPAC in striatum of rats

Fig 4 Effect of ECH on extracellular level of HIVV in striatum of rats

Fig 5 Effect of ECH on extracellular level of HVA in striatum of rats

Fig 6 Effect of ECH on extracellular level of 5-HT in striatum of rats

本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型所致的腦缺血損傷可使細(xì)胞外液中DA、NE和5-HT的含量升高，變化的幅度與缺血的時間和程度呈正相關(guān)。與此同時，其酸性代謝產(chǎn)物DOPAC，HVA，HIAA也隨之升高。這是由于腦缺血時，腦組織供血供氧減少，細(xì)胞內(nèi)能量耗竭，神經(jīng)遞質(zhì)再攝取受到抑制;另一方面單胺氧化酶活性下降，遞質(zhì)降解減少，二者致使單胺類遞質(zhì)及代謝物蓄積在細(xì)胞外，進(jìn)而產(chǎn)生腦缺血性神經(jīng)損害作用。在ECH和CXQ作用下，腦缺血大鼠紋狀體細(xì)胞外液中DA、5-HT、HVA、HIAA及 DOPAC水平均明顯下降，此可能是由于ECH和CXQ抑制了缺血期DA、和5-HT的過量釋放，減輕了DA、和5-HT合成、存儲和再攝取的代謝障礙，進(jìn)而起到了腦神經(jīng)保護(hù)作用。我們的實驗從ECH對腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)影響，初步探討ECH抗腦缺血的作用機制，為臨床應(yīng)用和深入的科學(xué)研究奠定了新的理論依據(jù)。

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