吳華偉，高金源，鄧 永，范 鵑，郎洪武，陳曉春

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.揚(yáng)州優(yōu)邦生物制藥有限公司，江蘇揚(yáng)州 225008)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)，屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬的成員，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒。自20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)該病毒以來，PCV2病毒在世界各國迅速蔓延。我國于2000年檢測到了該病毒的存在［1］。PCV2抗體檢測對(duì)于進(jìn)行PCV2流行病學(xué)調(diào)查、疫苗效果評(píng)價(jià)及試驗(yàn)用陰性豬的篩選等具有重要意義。目前，PCV2抗體檢測的常用方法有病毒中和試驗(yàn)(SN)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)法(IPMA)。鑒于SN方法費(fèi)時(shí)耗力，且PCV2病毒在細(xì)胞上很難出現(xiàn)細(xì)胞病變，常需借助免疫熒光試驗(yàn)(FA或IFA)進(jìn)行結(jié)果判定。因此常用ELISA或IPMA方法進(jìn)行PCV2抗體檢測。國內(nèi)已有商品化的豬圓環(huán)病毒PCV2抗體檢測試劑盒出售［2－3］。為了解目前國內(nèi)PCV2滅活疫苗效力檢驗(yàn)用PCV2抗體檢測試劑盒的質(zhì)量，本試驗(yàn)選取國內(nèi)5個(gè)廠家生產(chǎn)的5種PCV2抗體檢測試劑盒(其中4種為ELISA方法，1種為IP-MA方法)，分別對(duì)其進(jìn)行敏感性、特異性和符合率測定，為實(shí)際應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑盒 豬圓環(huán)病毒PCVII型抗體檢測試劑盒(荷蘭CEDI)，批號(hào)為170408;豬圓環(huán)病毒PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒(A企業(yè))，批號(hào)為081103;豬圓環(huán)病毒PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒(B企業(yè))，批號(hào)為100805;豬圓環(huán)病毒PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒(C企業(yè))，批號(hào)為100807;豬圓環(huán)病毒PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒(D企業(yè))，批號(hào)為20101101;豬圓環(huán)病毒PCV2抗體IPMA檢測試劑盒(E企業(yè))，批號(hào)為20100417。

1.2 檢測試劑和血清 檢測PCV2抗體用間接免疫熒光檢測板(96孔/塊)、PK15細(xì)胞空白對(duì)照板(96孔/塊)均由本實(shí)驗(yàn)室制備;FITC標(biāo)記的羊抗豬IgG為Sigma公司產(chǎn)品;PCV2陽性血清和陰性血清樣本，由本實(shí)驗(yàn)室鑒定和保存。

1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱(SANYO);微量移液器(effendorf);酶標(biāo)儀(Thermo/1500型);熒光顯微鏡(OLYMPUS/IX71型)。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清的確定 對(duì)本試驗(yàn)室保存的PCV2血清樣品，先采用荷蘭CEDI公司生產(chǎn)的豬圓環(huán)病毒PCVII型抗體檢測試劑盒進(jìn)行初篩，然后按文獻(xiàn)［4］的方法進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，以兩種方法檢測結(jié)果均一致的血清樣品作為標(biāo)準(zhǔn)血清樣品。

2.2 試劑盒敏感性、特異性和符合率測定 按各廠家提供的試劑盒使用說明書的操作方法，分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行檢測，參照農(nóng)業(yè)部第683號(hào)公告有關(guān)規(guī)定，評(píng)價(jià)國內(nèi)各試劑盒的敏感性、特異性和符合率。其計(jì)算公式如下:敏感性=(與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清檢測結(jié)果一致的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)陽性血清總份數(shù))×100%;特異性=(與標(biāo)準(zhǔn)陰性血清檢測結(jié)果一致的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)陰性血清總份數(shù))×100%;符合率=(與標(biāo)準(zhǔn)血清檢測結(jié)果一致的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)血清總份數(shù))×100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 5個(gè)企業(yè)的PCV2試劑盒的敏感性、特異性和符合率測定結(jié)果 按以上方法共篩選出57份標(biāo)準(zhǔn)血清樣品，其中標(biāo)準(zhǔn)陽性血清26份，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清31份。分別用5個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的PCV2抗體檢測試劑盒檢測57份標(biāo)準(zhǔn)血清，結(jié)果如表1所示。從敏感性測定結(jié)果看，企業(yè)A和企業(yè)E生產(chǎn)的PCV2抗體檢測試劑盒敏感性均達(dá)到100%(26/26)，而其他3個(gè)企業(yè)的PCV2抗體檢測試劑盒敏感性僅在57.7% ～76.9%;從特異性測定結(jié)果看，5個(gè)企業(yè)的試劑盒特異性基本保持在90%左右(87.1% ～93.5%);從符合率看，除企業(yè)C和企業(yè)D的PCV2抗體檢測試劑盒符合率較低，為75.4%，其余3個(gè)企業(yè)的PCV2抗體檢測試劑盒符合率在86%以上。表明國內(nèi)生產(chǎn)的PCV2抗體檢測試劑盒特異性相對(duì)較好，但不同廠家敏感性差異較大。

表1 5個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的PCV2抗體檢測試劑盒檢測57份標(biāo)準(zhǔn)血清結(jié)果

3.2 5個(gè)企業(yè)試劑盒間檢測結(jié)果的符合率測定從表2可以看出，5個(gè)企業(yè)試劑盒檢測與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清檢測結(jié)果完全一致的血清份數(shù)為36份(其中標(biāo)準(zhǔn)陽性血清19份，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清17份)，總體符合率為63.2%(36/57)。說明國內(nèi)各企業(yè)生產(chǎn)的PCV2抗體檢測試劑盒之間檢測結(jié)果的符合性較差，需要進(jìn)一步改進(jìn)。

表2 5個(gè)企業(yè)試劑盒間檢測結(jié)果的一致性

4 討論

盡管攻毒試驗(yàn)是評(píng)價(jià)PCV2滅活疫苗效力的最可靠方法，但因其操作繁瑣，且需要嚴(yán)格的生物安全措施，因此常采用PCV2抗體檢測作為PCV2滅活疫苗效力評(píng)價(jià)的替代方法。國內(nèi)企業(yè)已申報(bào)的PCV2滅活疫苗，如PCV2滅活疫苗(SH株)和PCV2滅活疫苗(DBN－SX07株)均采用ELISA方法進(jìn)行免疫動(dòng)物抗體水平檢測，而PCV2滅活疫苗(LG株)則采用IPMA方法進(jìn)行免疫動(dòng)物抗體水平檢測。然而，實(shí)際應(yīng)用中，大多數(shù)疫苗生產(chǎn)企業(yè)在進(jìn)行疫苗效力評(píng)價(jià)時(shí)所用的試劑盒均為自行制備的或購買的未獲國家批準(zhǔn)的產(chǎn)品，缺少必要的質(zhì)量驗(yàn)證和監(jiān)管措施，存在一定的質(zhì)量隱患。從本試驗(yàn)選取的5個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的PCV2抗體檢測試劑盒(其中企業(yè)A已獲農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)，其余4種均未獲準(zhǔn)正式生產(chǎn))的檢測結(jié)果看，企業(yè)A的ELISA試劑盒和企業(yè)E生產(chǎn)的PCV2－IPMA法檢測試劑盒敏感性和特異性相對(duì)較好，可以作為PCV2抗體監(jiān)測和疫苗效力評(píng)價(jià)的首選，其余3個(gè)企業(yè)的PCV2抗體檢測試劑盒敏感性較差，不太適合作為評(píng)價(jià)PCV2滅活疫苗免疫動(dòng)物后產(chǎn)生抗體的檢測手段，且各試劑盒間檢測結(jié)果的一致性較差。因此，在新獸用生物制品申報(bào)時(shí)，對(duì)采用未經(jīng)正式批準(zhǔn)的試劑或試劑盒進(jìn)行制品質(zhì)量的評(píng)價(jià)(特別是在有可能影響制品質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如試驗(yàn)豬篩選、效力檢驗(yàn)等)是否可行，以及如何加強(qiáng)對(duì)這些試劑或試劑盒的驗(yàn)證或管理，亟待有關(guān)部門深入研究，盡快出臺(tái)有關(guān)規(guī)定?？傮w上看，國內(nèi)的PCV2抗體檢測試劑盒種類繁多，質(zhì)量參差不齊?？蒲袉挝恍柽M(jìn)一步加大科研力度，獸醫(yī)行政部門需進(jìn)一步加強(qiáng)試劑盒技術(shù)規(guī)范，完善質(zhì)量驗(yàn)證的相關(guān)程序和制度，同時(shí)加強(qiáng)試劑盒監(jiān)督檢驗(yàn)力度，確保PCV2試劑盒敏感、特異、質(zhì)量可控，更好地服務(wù)于PCV2疫病監(jiān)測和防控工作。

［1］郎洪武，張廣川，吳發(fā)權(quán)，等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測［J］.中國獸醫(yī)科技，2000，30(3):325.

［2］農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第742號(hào)［Z］.

［3］農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1220號(hào)［Z］.

［4］Allan G M，Ellis J A.Porcine Circoviruses:a Review［J］.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2000，12(1):3 －14.