李 丹，張玉潔，汪 霞，應(yīng)永飛，林仙軍，扎依達(dá)，賈新建，薛 毅，仲 鋒

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.浙江省獸藥監(jiān)察所，杭州 310000;3.新疆獸藥飼料監(jiān)察所，烏魯木齊 830063;4.中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100026)

氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑?qū)儆诒讲⑦溥蝾愹?qū)蟲藥，對牛、羊的肝片吸蟲、大片形吸蟲及前后盤吸蟲均有良好的殺滅效果，且毒性較小。因此從1960年開始已經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中［1］。噻苯達(dá)唑?qū)Υ蟛糠治改c道線蟲，尤其是成蟲及特定的幼蟲有很好的驅(qū)蟲效果;氟苯達(dá)唑?qū)儆诳谷湎x藥，具有廣譜、高效的特點(diǎn)。氟苯達(dá)唑和噻苯達(dá)唑的廣泛使用在一定程度上對人類造成危害，因此必須采取有效的技術(shù)手段，對動(dòng)物性食品中的有關(guān)藥物殘留進(jìn)行檢測，以確保人類對動(dòng)物性食品消費(fèi)的安全。本研究旨在建立一種高效液相色譜法，可同時(shí)檢測羊組織(肌肉、肝臟、腎臟、脂肪)、雞組織(肌肉、肝臟)中氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑及代謝物2－氨基氟苯達(dá)唑、5－羥基噻苯達(dá)唑藥物的殘留。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑 Agilent 1100高效液相色譜儀(配紫外檢測器)，美國安捷倫公司;AE 240型分析天平;Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)，德國賀利氏公司;乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，美國Fisher公司;碳酸鈉、甲酸、鹽酸、氨水、乙酸銨、異辛烷、正丙醇、無水乙醇(分析純)，北京化工廠;氟苯達(dá)唑、2－氨基氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑、5－羥基噻苯達(dá)唑?qū)φ掌?，德國Adlershof Gmbh公司，含量均≥99.0%;MCX固相萃取柱(60 mg/3 cc)，Waters公司。

1.2 對照溶液的配制 氟苯達(dá)唑、2－氨基氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑和5－羥基噻苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制(1 mg/mL):稱取氟苯達(dá)唑、2－氨基氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑和5－羥基噻苯達(dá)唑?qū)φ掌芳s10 mg，精密稱定，于10 mL量瓶中，加甲醇及滴加10%鹽酸溶液溶解后，用甲醇稀釋至刻度，制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－20℃以下保存，有效期6個(gè)月。

氟苯達(dá)唑、2－氨基氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑和5－羥基噻苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)工作液配制(10 μg/mL):準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1 mL，于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋成氟苯達(dá)唑、2－氨基氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑和5－羥基噻苯達(dá)唑10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。2～8℃保存，有效期1個(gè)月。

1.3 色譜條件 流動(dòng)相 A相為0.02 mol/L乙酸銨溶液，B相為乙腈，梯度洗脫程序如表1所示。

色譜柱 Hypersil C18，250 mm ×4.6 mm(i.d)，粒徑 5 μm，或相當(dāng)者;檢測波長 306 nm;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量 20 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

1.4 組織樣品的提取與凈化 稱取(2±0.05)g試料，于50 mL離心管中，加2%碳酸鈉溶液0.5 mL、乙腈8 mL、異辛烷5 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min，5000 r/min離心5 min，取下層清液于50 mL雞心瓶中。殘?jiān)偌?%碳酸鈉溶液0.5 mL、乙腈8 mL重復(fù)提取一次，合并兩次下層清液，加正丙醇5 mL。于50℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入30%鹽酸乙醇溶液8 mL，渦旋混勻后備用。

依次用甲醇3 mL、2%甲酸水溶液3 mL，活化MCX固相萃取柱。將備用液過柱。依次用2%甲酸水溶液3 mL、甲醇3 mL淋洗，抽干。用5%氨化甲醇溶液3 mL洗脫。洗脫液于50℃水浴下用氮?dú)獯蹈?。用流?dòng)相1.0 mL(0.02 mol/L乙酸銨溶液∶乙腈=85∶15)溶解，混勻。過濾膜后作為試料溶液，供高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇 參考國內(nèi)外有關(guān)資料，并對氟苯達(dá)唑、2－氨基氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑和5－羥基噻苯達(dá)唑進(jìn)行紫外掃描，考慮要同時(shí)檢測四種藥物，最終確立其檢測波長為306 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 準(zhǔn)確量取適量氟苯達(dá)唑、2－氨基氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑、5－羥基噻苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相稀釋成濃度分別為0.02、0.04、0.1、0.2、0.3、0.6、1.5 μg/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將此系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次從低濃度到高濃度按液相色譜條件進(jìn)行分析，每一濃度進(jìn)樣三次，按其所得三次峰面積的平均值與對應(yīng)的對照溶液的質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)(表2)。

表2 氟苯達(dá)唑、2－氨基氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑和5－羥基噻苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 樣品提取 國內(nèi)外關(guān)于測定羊、雞組織中氟苯達(dá)唑、2－氨基氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑和5－羥基噻苯達(dá)唑藥物殘留的報(bào)道，有液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜、熒光檢測及紫外檢測等方法，但檢測波長均有不同。藥物殘留提取方法的手段也均不相同，有液－液提取、液－固提取等。參考國內(nèi)外的文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)最初采用液 －固提取的方法，使用 C18、HLB、MAX、MCX、硅膠等固相萃取柱，采用的提取液有不同濃度的無機(jī)鹽溶液及直接用有機(jī)溶液提取，經(jīng)過多次試驗(yàn)反復(fù)摸索，最終采用液－固提取，用乙腈作為提取液，從羊、雞組織中提取藥物殘留。

在方法研究過程中，分別用甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑作為提取液，再加入少量的酸、堿溶液，以便更有利于藥物殘留的提取。經(jīng)過試驗(yàn)摸索用乙腈提取，其回收率較為理想。

在提取實(shí)驗(yàn)中，分別在提取液中加入少量的酸、堿溶液。其結(jié)果是加入少量的堿溶液比加酸溶液，其效果更為明顯。在兩次提取時(shí)均要加堿，如果僅加一次堿，其回收率明顯降低。經(jīng)過多次試驗(yàn)反復(fù)摸索，在用乙腈作為提取液的同時(shí)，加入0.5 mL的碳酸鈉溶液，提高了提取效率。同時(shí)對1%、2%、3%、5%四種不同濃度的碳酸鈉溶液進(jìn)行了考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入2%碳酸鈉溶液時(shí)提取效率是最高的。因此，最終確立加入碳酸鈉溶液的濃度是2%。

在提取脫脂過程中，分別用異辛烷、正己烷等作為脫脂溶劑進(jìn)行了試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用異辛烷明顯要好于正己烷，因此選用異辛烷作為脫脂溶劑。

通過上述樣品提取方法和色譜條件，空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液的高效液相色譜圖分別如圖1、圖2、圖3所示。

2.4 方法準(zhǔn)確度和精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，選取3種不同濃度，藥物在羊肝、腎、肌肉、脂肪四種組織的最高殘留限量均為100 μg/kg，選取的三種濃度為20、100、200 μg/kg。藥物在雞肌肉中的最高殘留限量為 200 μg/kg，選取的三種濃度為 20、200、400 μg/kg。藥物在雞肝臟中的最高殘留限量為500 μg/kg，選取的三種濃度為 20、500、800 μg/kg。選取的三種濃度基本包含了上述藥物進(jìn)行殘留檢測的要求，其中靈敏度為20 μg/kg的濃度點(diǎn)為定量限。每種濃度5個(gè)樣品，重復(fù)3批次，求回收率，批內(nèi)、批間變異系數(shù)。測定結(jié)果如表3～表6所示。

表3 羊腎、羊肝中氟苯達(dá)唑、2－氨基氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑和5－羥基噻苯達(dá)唑回收率測定結(jié)果

(續(xù)表)

表4 羊肉、羊脂肪中氟苯達(dá)唑、2－氨基氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑和5－羥基噻苯達(dá)唑回收率測定結(jié)果

(續(xù)表)

從上述表中數(shù)據(jù)可以看出，無論是各種添加濃度的回收率，還是批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均符合農(nóng)業(yè)部農(nóng)發(fā)［2003］1號關(guān)于發(fā)布《獸藥殘留試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范(試行)》通知中規(guī)定的要求。此方法提取過程簡單，操作步驟少，所用化學(xué)試劑的量也少，減少了對環(huán)境的污染。此方法適用于羊、雞組織中上述藥物殘留的檢測。

表6 雞肝中氟苯達(dá)唑、2－氨基氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑和5－羥基噻苯達(dá)唑回收率測定結(jié)果

［1］陳杖榴.獸醫(yī)藥理學(xué)［M］.第2版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002:282.