吳 濤，毛婭卿，王 嘉，王 哲，蔣桃珍

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

雞新城疫(ND)是一種具有高度傳染性的病毒性疾病，世界各地養(yǎng)禽業(yè)均采用疫苗進(jìn)行免疫接種來控制雞新城疫的發(fā)生［1］。雞新城疫病毒HB1株(Ⅱ系)和F株(Ⅲ系)是制備雞新城疫低毒力活疫苗的生產(chǎn)用毒種，《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》［2］(二〇〇〇年版)中規(guī)定，雞新城疫病毒HB1株和F株，在－15℃以下，保存期為6年。對(duì)疫苗生產(chǎn)用毒種的繁殖凍干與檢定，不僅需要較長(zhǎng)的時(shí)間，還消耗一定的人力、物力和財(cái)力，增加污染外源病毒的機(jī)會(huì)，因此需要對(duì)毒種制定更加合理的保存期。

1 材料和方法

1.1 材料 雞新城疫病毒HB1株(Ⅱ系)，本實(shí)驗(yàn)室分別在1993年6月、1997年3月、2003年2月繁殖凍干，檢定合格后交菌種保藏室－70℃保存。雞新城疫病毒F株(Ⅲ系)，本實(shí)驗(yàn)室分別在1989年12月、1995年4月、2001年3月繁殖凍干，－70℃保存。雞新城疫強(qiáng)毒(北京株)，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所2006年6月凍干、檢定，－70℃保存。

SPF雞:1月齡，SPF雞胚:10日齡，均購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毒種病毒含量測(cè)定 每批凍干的毒種在試驗(yàn)時(shí)從－70℃冰柜中任取3支，按照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(二〇〇〇年版)中病毒含量測(cè)定方法，分別按瓶簽注明的裝量加滅菌生理鹽水恢復(fù)后，繼續(xù)做10倍系列稀釋至 10－9，取10－7、10－8、10－9三個(gè)滴度，各經(jīng)尿囊腔途徑接種 10日齡SPF雞胚5枚，每胚接種0.1 mL，至37℃條件孵育，每日照蛋。孵育120 h后，取出所有活胚，逐個(gè)收獲胚液，分別測(cè)定血凝價(jià);48～120 h死胚(48 h以前死胚，棄去不計(jì))同一稀釋度等量混合，分別測(cè)定血凝價(jià)，計(jì)算EID50。

1.2.2 毒種的免疫原性鑒定

1.2.2.1 接種 每批種毒任取1支，用滅菌生理鹽水分別進(jìn)行稀釋，使其含毒量分別為2500 EID50/0.1 mL、5000 EID50/0.1 mL 和 10000 EID50/0.1 mL，每個(gè)滴度滴鼻接種1月齡SPF雞10只，每只滴鼻0.1 mL;同時(shí)設(shè)空白對(duì)照5只，隔離飼養(yǎng)觀察14 d。

1.2.2.2 攻毒 取ND強(qiáng)毒(北京株)1支，用滅菌生理鹽水進(jìn)行105倍稀釋后，對(duì)所有雞進(jìn)行攻毒，每只雞肌肉注射1 mL(含毒104ELD50/mL)，隔離飼養(yǎng)觀察14 d。

2 結(jié)果

2.1 毒種的病毒含量測(cè)定 結(jié)果如表1、表2所示。

表1 不同保存年代的新城疫病毒HB1株病毒含量測(cè)定結(jié)果

表2 不同保存年代的新城疫病毒F株病毒含量測(cè)定結(jié)果

由表1和表2可以看出，雞新城疫病毒HB1株和F株毒種在－70℃分別保存16年和19年，病毒含量仍符合《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(二〇〇 〇 年 版)［2］規(guī) 定 (病 毒 含 量應(yīng) ≥108.0EID50/0.1 mL)。

2.2 毒種的免疫原性鑒定 結(jié)果如表3、表4所示。

表3 不同保存年代的新城疫病毒HB1株免疫原性試驗(yàn)結(jié)果

表4 不同保存年代的新城疫病毒F株免疫原性試驗(yàn)結(jié)果

由表3和表4可以看出，雞新城疫病毒HB1株和F株毒種在－70℃分別保存16年和19年，免疫原性仍符合《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(二〇〇〇年版)中最小免疫量應(yīng)≤5000 EID50的規(guī)定。

3 討論

3.1 對(duì)疫苗生產(chǎn)用毒種的繁殖凍干與檢定，不僅需要較長(zhǎng)的時(shí)間，消耗一定的人力、物力和財(cái)力，而且還會(huì)增加污染外源病毒的機(jī)會(huì)，因此需要對(duì)毒種的保存制定更加合理的保存期。按照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(二〇〇〇年版)的規(guī)定，雞新城疫病毒HB1株和F株毒種在－15℃的保存期為6年。從本試驗(yàn)的結(jié)果看，新城疫病毒HB1株毒種在－70℃條件下保存6年、12年、16年;新城疫病毒F株毒種在－70℃條件下保存8年、14年、19年，病毒含量、免疫原性均無明顯變化，均符合《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(二〇〇〇年版)規(guī)定。本試驗(yàn)結(jié)果表明，可延長(zhǎng)新城疫病毒HB1株和F株毒種的保存期。

3.2 雞新城疫病毒HB1株和F株毒種在繁殖凍干時(shí)已按《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(二〇〇〇年版)進(jìn)行了相應(yīng)的鑒定工作，此次保存期試驗(yàn)對(duì)不同保存年代毒株的病毒含量和免疫原性進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果均符合規(guī)定，表明該毒株在－70℃保存15年以上仍可作為制備雞新城疫低毒力活疫苗毒種使用。

［1］殷 震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.第2版.北京:科學(xué)出版社，1997:748－749.

［2］農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程(二〇〇〇年版)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000:220－221.