王新敏 章 樂 王勤章 丁國富 (石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆 石河子 832000)

目前認為雄激素在前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)的發(fā)病中起重要作用，而雄激素受體是雄激素發(fā)揮作用的中心環(huán)節(jié)〔1〕。P21活化激酶6(p21-activated kinase 6，PAK6)是通過酵母雙雜交識別出來的雄激素受體關聯(lián)蛋白〔2〕，可參與雄激素受體的旁路調節(jié)。PAK6可與雄激素受體的配體結合域結合，是惟一已知的能與雄激素受體相互作用的PAK家族成員。但PAK6在PCa中的作用機制尚未完全明了。本實驗采用免疫組織化學法和RT-PCR方法檢測PCa和前列腺增生的組織中PAK6基因、蛋白表達情況，以探討其與PCa發(fā)生和病理分級的相關性。

1 材料與方法

1.1 標本來源 石蠟組織標本:收集新疆石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科1998～2008年PCa組織標本(n=70)及前列腺增生組織標本(n=20)。標本均經10%甲醛固定12～24 h后，常規(guī)石蠟包埋存檔。其中高分化11例，中分化19例，低分化40例。新鮮標本:收集新疆石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2007～2008年PCa新鮮組織標本(n=10)及前列腺增生新鮮組織標本(n=10)，液氮保存。切片均經兩位資深病理醫(yī)生復查確診。

1.2 主要試劑 PAK6多克隆抗體(IMGENGX公司，美國);Trizol(Invitrogen公司，美國);RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas公司);PrimeSTARTM HS DNA多聚酶(TaKaRa公司)。

1.3 免疫組織化學

1.3.1 SP法 石蠟包埋組織后4μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化，PBS沖洗。高溫修復抗原，冷卻至室溫，PBS沖洗2×3 min，滴加一抗，4℃孵育過夜。PBS沖洗3×5 min，滴加生物素標記的二抗。室溫下孵育10 min，PBS沖洗3×3 min，聯(lián)苯二胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。

1.3.2 結果判斷 以半定量積分法〔3〕判斷每張切片PAK6的表達結果，以陽性細胞比例與顯色強度計分。(1)染色強度:分為0～3級，陰性為0，無淡黃色及棕黃色顆粒，或陽性顆粒＜10%;弱陽性為1，淡黃或棕黃色顆粒占10% ～30%;中等強度為2，淡黃或棕黃色顆粒占30% ～60%;強陽性為3，淡黃或棕黃色顆粒＞60%。(2)陽性細胞比例:＜30%為1分，30% ～65%為2分，＞65%為3分。(1)+(2)兩者相加為積分，用陽性系數(shù)大小表示蛋白質表達的高低:積分0～1者為陰性，2分為弱陽性，3～4分為陽性，＞4分為強陽性。

1.4 PAK6 mRNA表達

1.4.1 引物序列 所有引物由TaKaRa公司合成。β-actin(695 bp):5'-caccacaccttctacaatgagc-3';5'-gtgatctccttctgcatcctgt-3'。PAK6(315 bp):5'-caggtctttgtatgccactgag-3';5'-ggaggtctgctttcggtagag-3'。

1.4.2 RT-PCR 檢測PAK6 mRNA表達取50 mg組織放入1.5 ml EP管中，加入1 ml Trizol，做組織勻漿，提取出總RNA，取2μl RNA樣品，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳以觀察所提RNA質量;取2μl RNA稀釋至100μl，用紫外分光光度計測OD260、OD280值，以測定RNA純度和濃度。貯存于-70℃?zhèn)溆?。以定量的總RNA為模板，按RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA;以合成的cDNA為模板，利用前述引物，分別對β-actin與PAK6進行PCR擴增，PCR反應條件:94℃預變性4 min后，進行 30輪循環(huán)(94℃ 45 s，56℃ 35 s，72℃ 30 s)，最后72℃延伸5 min。然后對PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.3 半定量結果分析 通過凝膠成像密度掃描系統(tǒng)測定各擴增條帶的光密度積分值。結果采用Quatity One軟件分析，以PAK6擴增條帶的光密度積分與對應β-actin擴增條帶的光密度積分之比值表示，并以此相對光密度積分值作為半定量指標，反映PAK6基因的相對mRNA水平。實驗重復3次，以確保結果的可靠性。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗及Spearman等級相關分析;計量數(shù)據(jù)以±s表示，One-Way ANOVA方法對組間數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 PAK6在前列腺增生和PCa組織中的表達 20例前列腺增生的標本中 PAK6陽性率為70%(6/14)。70例 PCa中PAK6陽性率為 95.7%(3/67)，組間比較差異顯著(χ2=11.429，P=0.01)。見表1。

2.2 PAK6在不同分化程度前列腺癌組織中的表達 高分化PCa組織由癌體排列、彼此分離的腺體構成，腺體中等大小，基本相似;中分化PCa組織分化中等，腺體大小不一，形態(tài)不規(guī)則;低分化PCa，腺腔結構基本消失，上皮細胞排列成實性片狀、條索狀;由高分化至低分化Pca，其PAK6染色強度逐漸增加。70例高、中、低分化PCa的PAK6表達陽性率逐漸升高，經Spearman等級相關分析，PCa的分化情況與PAK6的表達強度呈正相關性，相關系數(shù)為0.502，P＜0.01。見圖1，表2。

2.3 RT-PCR結果 PAK6和β-actin在前列腺增生和PCa組織中均得到表達片段，分別為315 bp和695 bp。β-actin的條帶表達較為均一，但PCa組織中的PAK6條帶明顯亮于前列腺增生組織。見圖2。半定量結果分析表明，前列腺增生組織的PAK6/β-actinmRNA光密度之比為0.21±0.06，PCa組織的PAK6/β-actinmRNA光密度之比為0.74±0.07，兩者有顯著性差異(P＜0.01)。

表1 PAK6在前列腺增生和PCa組織中的表達(n)

表2 PAK6在不同分化程度PCa組織中的表達(n)

圖1 PAK6在不同分化程度PCa組織中的表達(×400)

圖2 RT-PCR檢測PAK6基因在前列腺增生和前列腺癌組織中的表達

3 討論

PAK是一類進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶〔4〕。作為小G蛋白Rho家族的下游靶蛋白，可被生長因子及其他胞外信號活化。PAK包括2個亞家族(PAKⅠ和PAKⅡ)，6個家族成員(PAK1～6)〔5〕。PAK1～PAK5參與調節(jié)細胞骨架、細胞生存、有絲分裂和血管生成等生物學功能，在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉移過程中起著重要作用〔6〕。Ⅱ類PAK家族中的PAK6在激素信號轉導中起重要作用〔7〕。PCa生物學特性非常復雜，目前對其演變過程及預后尚缺乏深入的了解。但可以肯定的是，雄激素及其受體與前列腺的發(fā)育和PCa的發(fā)生有密切關系〔8〕。而PAK6研究表明，PAK6能夠與雌激素受體及雄激素受體相互作用并抑制雌激素受體及雄激素受體的轉錄激活作用。

PAK6作為惟一可與雄激素受體作用的PAK蛋白，在PCa中的作用機制尚未完全明了。PAK6可與雄激素受體的配體結合域上的氨基酸序列結合，更為重要的是激活的PAK6能抑制已受刺激的雄激素受體的核轉位〔9〕。PAK6結合雄激素受體并與之共定位于細胞核內，抑制雄激素受體介導的基因轉錄〔10〕。這種抑制不是雄激素受體表達減少的結果，也不是PAK6對雄激素受體磷酸化減弱的結果，相反顯示的是PAK6結合到雄激素受體上阻止雄激素受體結合轉錄激活劑的結果。PAK6與核受體的相互作用表明核激素受體與小GTP酶介導的信號傳遞途徑有交互作用，推測PAK6可能參與PCa和乳腺癌等與激素相關的腫瘤的生物學行為。本研究通過免疫組織化學方法檢測70例PCa和20例前列腺增生標本的PAK6表達，發(fā)現(xiàn)前列腺增生和PCa中PAK6均可以表達，但陽性表達率分別為70%和95.7%。由于石蠟組織的RNA保存不完好，提取較為困難，恐有漏檢情況出現(xiàn)，因此，本研究收集了2007～2008年的新鮮組織樣本，對其進行半定量RT-PCR檢測PAK6 mRNA表達情況，結果與免疫組織化學檢測結果一致。提示無論是在mRNA水平還是在蛋白水平上，PAK6在前列腺增生和PCa新鮮組織中均有表達，但表達程度不一樣，PCa的表達水平明顯高于前列腺增生組織，兩者有顯著性差異。免疫組織化學檢測還發(fā)現(xiàn)，在不同分化程度的PCa組織中PAK6表達與PCa的分化等級明顯呈正相關性，PAK6陽性表達率和表達程度隨著惡性度的增高明顯增加。這可能與PAK6與雄激素受體之間的信號轉導通路有關?？赡苷怯捎诘头只疨Ca組織的雄激素表達大量增加，使PAK6分泌量增加，力圖抑制已受刺激的雄激素受體進行核轉位。增多的PAK6結合雄激素受體并與之共定位于細胞核內，抑制雄激素與雄激素受體結合介導的下游信號的傳遞。所以在低分化PCa細胞中，PAK6陽性表達增強，提示PAK6表達增強與PCa細胞惡性程度有關。因新鮮組織的PCa樣本數(shù)較少，今后還應當進一步擴大樣本數(shù)做更深入的研究。

本研究結果初步表明，PAK6可能參與了PCa與激素相關的腫瘤的生物學行為，并有助于明確PAK6在PCa發(fā)生發(fā)展中的作用，提示臨床上若要全面阻斷雄激素作用，除要阻斷雄激素受體的信號外，還需抑制其旁路蛋白的激酶活性，為臨床研究、診斷、治療PCa提供新的思路。

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