方 玲 劉先哲 余 旻 鮑榮輝 胡藝瓊 朱志林 井 景 劉曉光 李俊明

(宜昌市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 宜昌 443002)

在動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，活化的Toll樣受體2(TLR2)能夠促進(jìn)內(nèi)膜粥樣斑塊形成及AS進(jìn)展〔1，2〕，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)則作用于心血管的特異性受體，通過(guò)各種不同途徑，最終引起 AS〔3〕，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(TGF-β)在 AS 過(guò)程中則可以延緩AS病變的發(fā)展過(guò)程，從而發(fā)揮保護(hù)性作用〔4，5〕。早期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)AngⅡ能夠使細(xì)胞TGF-β的表達(dá)增加〔6〕，同時(shí)TGF-β可調(diào)節(jié)AngⅡ誘導(dǎo)心室重構(gòu)〔7〕。近期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGF-β對(duì)不同配體誘導(dǎo)的TLR2表達(dá)的調(diào)控具有不同的作用〔8，9〕。本課題前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了AngⅡ能夠下調(diào)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HECV)TLR2表達(dá)，本文采用 TGF-β的抑制劑Decorin刺激體外培養(yǎng)的HECV，觀察TGF-β在AngⅡ?qū)?TLR2表達(dá)影響的過(guò)程中有何種作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HECV-304購(gòu)自武漢典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù);RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、AngⅡ購(gòu)自Sigma公司;Decorin購(gòu)自R＆D公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物技術(shù)有限公司;Trizol試劑購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;實(shí)時(shí)定量PCR各種試劑均購(gòu)自Promega;DNA Maker購(gòu)自TaKaRa公司;Western及免疫沉淀(IP)細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;TLR2一抗、二抗購(gòu)自R＆D公司;蛋白Marker購(gòu)自Fermentas公司;DAB試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HECV-304的傳代培養(yǎng)及分組收到定購(gòu)的細(xì)胞后先將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液在超凈工作臺(tái)內(nèi)用吸管全部吸出，置于另一無(wú)菌容器，再向培養(yǎng)瓶中加入1 ml胰蛋白酶，37℃消化直到細(xì)胞脫落，換新的培養(yǎng)瓶，加入吸出的培養(yǎng)液5 ml，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到90%以上單層融合狀態(tài)時(shí)，即可加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，按1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞分為①正常對(duì)照組:取2瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HECV-304細(xì)胞進(jìn)行1∶2傳代(傳代后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為104/ml，每瓶接種細(xì)胞懸液5 ml)，待細(xì)胞貼壁后(約傳代后4 h)每瓶細(xì)胞分別加入高壓滅菌的PBS溶液100μl，培養(yǎng)20 h后每瓶細(xì)胞內(nèi)加入高壓滅菌的三蒸水500μl，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。②AngⅡ刺激組:取2瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HECV-304細(xì)胞進(jìn)行1∶2傳代(傳代后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為104/ml，每瓶接種細(xì)胞懸液5 ml)，恒溫培養(yǎng)24 h后每瓶細(xì)胞分別加入 10-4、10-5、10-6、10-7mol/L 的 AngⅡ溶液 500 μl，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。測(cè)定各組細(xì)胞TLR2蛋白及基因的表達(dá)量。②AngⅡ+Decorin刺激組:取2瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HECV-304細(xì)胞進(jìn)行1∶2傳代(傳代后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為104/ml，每瓶接種細(xì)胞懸液5 ml)，待細(xì)胞貼壁后(約傳代后4 h)每瓶細(xì)胞分別加入80、40、20、10 μg/ml的 Decorin溶液100 μl，培養(yǎng)20 h后每瓶細(xì)胞內(nèi)加入10-5mol/L的AngⅡ溶液500μl，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR各組細(xì)胞按照上述分組方法處理后收集并提取總RNA 采用Trizol試劑一步法抽提，并對(duì)抽提的RNA用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，以確定RNA的純度及完整性。實(shí)時(shí)定量PCR采用兩步法:各組RNA定量2μg、5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl、100 mmol/L二硫代蘇糖醇(DTT)1μl、100 μmol/L Oligo(dT15)1 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl加 DEPC 處理水至總體積為18μl，稍離心65℃溫育5 min后置于冰上，加入逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(100 U/μl)2 μl，37℃ 逆轉(zhuǎn)錄60 min，94℃ 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR反應(yīng)體系:0.5 mmol/L dNTP 1 μl、10 × PCR 緩沖液 2 μl、25 mmol/L MgCl22 μl、2.5 U/μl Taq DNA 聚合酶 0.4 μl、滅菌三蒸水 9.6 μl、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl、4μmol/L上游引物 1 μl、4 μmol/L下游引物 1 μl、Taqma探針1μl。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性94℃ 3 min、變性95℃10 min 1個(gè)循環(huán)，退火95℃ 15 s、延伸56℃ 1 min 40個(gè)循環(huán)。TLR2上游引物序列:5'-CTACTGGGTGGAGAACCTTATGGT-3'，TLR2下游引物序列:5'-CCGCTTATGAAGACACAACTTGA-3'，cDNA 長(zhǎng)度77 bp，TLR2 探針序列:5'-CAGGAGCTGGAGAACTTCAATCCCCC-3';GAPDH上游引物序列:5'-GAAG-GTGAAGGTCGGAGTC-3'，GAPDH下游引物序列:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，cDNA 長(zhǎng)度225 bp，GAPDH 探針序列:5'-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3'。PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠電泳(90 V，20 min)，Gene Genius凝膠分析系統(tǒng)成像。

1.2.3 Western印跡 各組細(xì)胞按照上述分組方法處理后采用Western及IP細(xì)胞裂解液一步法，收集并制備蛋白樣品。各取含蛋白樣品50μg的提取液，以濃縮膠體積分?jǐn)?shù)為4%，分離膠體積分?jǐn)?shù)為10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠120 V，分離膠80 V，電泳4～5 h分離。電泳完畢后用半干電轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(60 V轉(zhuǎn)移2 h)，在室溫下用封閉液(5%脫脂奶粉，0.05%Tween20，TBS)封閉1 h。然后依次與 TLR2的一抗、二抗在室溫下孵育1～2 h，DAB顯色并照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β抑制劑 Decorin減弱 AngⅡ?qū)w外培養(yǎng) HECV TLR2蛋白表達(dá)的下調(diào)作用 以β-actin為內(nèi)參照，在加入相同量蛋白樣品的情況下，AngⅡ+Decorin刺激組TLR2蛋白的表達(dá)量明顯高于AngⅡ刺激組。見(jiàn)圖1、圖2。

2.2 TGF-β抑制劑 Decorin減弱 AngⅡ?qū)w外培養(yǎng) HECV TLR2基因表達(dá)的下調(diào)作用 GAPDH為內(nèi)參照，在加入相同量RNA的情況下，AngⅡ+Decorin刺激組TLR2基因的表達(dá)量明顯高于AngⅡ刺激組，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.864 0)，在沒(méi)有Decorin刺激時(shí)TLR2基因的表達(dá)量明顯降低(0.000 2)，10μg/ml Decorin刺激后TLR2基因的表達(dá)有所升高(0.005 6)，并隨 Decorin濃度增大表達(dá)升高越明顯，80μg/ml Decorin刺激后 TLR2基因的表達(dá)升至最高(0.381 2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1，圖3。

表1 TGF-β抑制劑Decorin在AngⅡ?qū)LR2基因調(diào)控中的影響(±s)

表1 TGF-β抑制劑Decorin在AngⅡ?qū)LR2基因調(diào)控中的影響(±s)

與10-5 mol/L AngⅡ組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;CT值為RT-PCR后得出的各基因的相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)公式△CT=CTTimeX-CTTime0計(jì)算出2-△△CT，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;目的基因CT代表TLR2基因的相對(duì)表達(dá)量;內(nèi)參基因CT代表管家基因GADPH的相對(duì)表達(dá)量

組別 目的基因CT 內(nèi)參基因CT 2-△△CT 20.697 3±0.275 0 7.082 3±0.363 9 0.000 2 10μg/mlDecorin+10-5 mol/L AngⅡ組 18.349 7±0.350 4 9.095 7±0.287 3 0.005 61)20μg/mlDecorin+10-5 mol/L AngⅡ組 22.683 7±0.278 2 16.598 0±0.230 5 0.028 92)40μg/mlDecorin+10-5 mol/L AngⅡ組 21.222 7±0.173 1 16.826 7±0.210 6 0.093 22)80μg/mlDecorin+10-5 mol/L AngⅡ組 9.842 3±0.139 3 7.478 3±0.171 2 0.381 22)10-5 mol/L AngⅡ組

圖1 AngⅡ+Decorin刺激組TLR2蛋白表達(dá)

圖2 AngⅡ刺激組TLR2蛋白表達(dá)

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討論

AS的炎癥浸潤(rùn)通常存在于動(dòng)脈壁的內(nèi)膜層和外膜層，作為動(dòng)脈內(nèi)膜的最主要組成細(xì)胞，已經(jīng)證實(shí)了內(nèi)皮細(xì)胞在動(dòng)物模型中參與了內(nèi)膜的損傷，AngⅡ以自分泌或旁分泌的方式作用于循環(huán)系統(tǒng)的特異性受體，從而影響血流動(dòng)力學(xué)，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和動(dòng)脈炎癥的發(fā)生，并最終導(dǎo)致AS的發(fā)生〔10〕。同時(shí)越來(lái)越多的證據(jù)表明血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的TLR2能夠通過(guò)不同的途徑引起促炎細(xì)胞因子與趨化因子的大量釋放，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的活化、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的遷移和增殖、單核細(xì)胞的募集，促進(jìn)內(nèi)膜粥樣斑塊的形成。另外，TGF-β在AS過(guò)程中通過(guò)抑制VSMC的遷移、促進(jìn)ECM的形成、抑制血管內(nèi)皮促炎黏附分子的表達(dá)以及減少體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞的形成等作用延緩AS病變的發(fā)展過(guò)程，從而發(fā)揮保護(hù)性作用。已經(jīng)有研究證實(shí)TGF-β對(duì)不同配體引起的體內(nèi)外TLR2的表達(dá)具有不同的影響作用，但TGF-β抑制劑Decorin在AngⅡ?qū)LR2表達(dá)調(diào)控中的作用還沒(méi)有研究過(guò)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) TGF-β抑制劑Decorin減弱了AngⅡ?qū)LR2蛋白及基因表達(dá)的下調(diào)作用，并且隨著其濃度的增加加強(qiáng)作用越強(qiáng)，但另一方面，還必須弄清楚TGF-β本身對(duì)TLR2的表達(dá)具有什么影響，這樣才能更加準(zhǔn)確地知道TGF-β的作用到底是通過(guò)AngⅡ或其他因子實(shí)現(xiàn)的還是直接影響了TLR2，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中選取的Decorin濃度有限，只有4個(gè)不同濃度，無(wú)法預(yù)知在其濃度更大或更小時(shí)對(duì)TLR2的表達(dá)有沒(méi)有影響，影響與目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否一致，目前關(guān)于TGF-β-AngⅡ-TLR2之間調(diào)節(jié)的具體機(jī)制和信號(hào)通路還十分模糊，還需要通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

1 Dunzendorfer S，Lee HK，Tobias PS.Flow-dependent regulation of endothelial Toll-like receptor 2 expression through inhibition of SP1 activity〔J〕.Circ Res，2004;95(7):684-91.

2 Okamura Y，Watari M，Jerud ES，et al.The extra domain A of fibronectin activates Toll-like receptor 4〔J〕.J Biol Chem，2001;276(13):10229-33.

3 Cheng ZJ，Vapaatalo H，Mervaala E.AngiotensinⅡand vascular inflammation〔J〕.Med Sci Monit，2005;11(6):194-205.

4 Metcalfe JC，Grainger DJ.Transforming growth factor-beta and the protection from cardiovascular injury hypothesis〔J〕.Biochem Soc Trans，1995;23(3):403-6.

5 Argmann CA，Van Den Diepstraten CH，Sawyez CG，et al.Transforming growth factor-beta 1 inhibits macrophage cholesteryl ester accumulation induced by native and oxidized VLDL remnants〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001;21(11):2011-8.

6 Lee AA，Dillmann WH，McCulloch AD，et al.Angiotensin IIstimulates the autocrine production of transforming growth factor-beta 1 in adult rat cardiac fibroblasts〔J〕.JMol Cell Cardiol，1995;27(10):2347-57.

7 Rosenkranz S.TGF-beta1 and angiotensin networking in cardiac remodeling〔J〕.Cardiovasc Res，2004;63(3):423-32.

8 Matsumura T，Hayashi H，Takii T，et al.TGF-beta down-regulates IL-1 alpha induced TLR2 expression in murine hepatocytes〔J〕.J Leukoc Biol，2004;75(6):1056-61.

9 Mikami F，Lim JH，Ishinaga H，et al.The transforming growth factor-β-Smad3/4 signaling pathway acts as a positive regulator for TLR2 induction by bacteria via a dual mechanism involving functional cooperation with NF-κB and MAPK phosphatase 1-dependent negative cross-talk with p38 MAPK〔J〕.Biol Chem，2006;281(31):22397-408.

10 Melo LG，Gnecchi M，Pachori AS，et al.Endothelium-targeted gene and cell-based therapies for cardiovascular disease〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004;24(10):1761-74.