張彥榮 高 翔 蔡建輝 (河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

缺血-再灌注損傷(IRI)不僅損傷肢體局部組織，而且可影響遠(yuǎn)隔的內(nèi)臟器官，引起多器官功能衰竭，危及生命〔1〕。下肢缺血再灌注引起的急性腎損傷是臨床上常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)生機(jī)制復(fù)雜。有研究顯示，骨骼肌IRI早期，氧自由基、炎性因子的作用是導(dǎo)致遠(yuǎn)隔腎損傷的主要原因。本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠后肢肌肉IRI后腎損傷進(jìn)行研究，觀察細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達(dá)變化，初步探討骨骼肌IRI致遠(yuǎn)隔腎損傷的部分機(jī)制及缺血后處理的保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康清潔級Wistar大鼠24只，雄性，體重200～250 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、RIPA組織蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒均為美國Pierce公司產(chǎn)品，小鼠ICAM-1單克隆抗體、小鼠β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗小鼠IgG均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒由南京建成生物工程研究提供。

1.3 分組 將24只大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，Ⅰ組為對照組，只進(jìn)行麻醉不阻斷血流;Ⅱ組為缺血4 h無再灌注組;Ⅲ組為缺血4 h再灌注6 h;Ⅳ組為缺血3 h 57 min并于再灌注前給予1 min灌注、1 min缺血，重復(fù)3次后再灌注5 h 57 min。

1.4 模型制備 1 g/L拉坦(5 mg/kg)腹腔注射麻醉下，以橡皮帶環(huán)繞結(jié)扎大鼠雙后肢根部，使后肢缺血4 h，去除止血帶實(shí)現(xiàn)再灌注〔2〕。按各組設(shè)定時(shí)間處理動(dòng)物，分別取材。

1.5 BUN及SOD檢測 按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間處理動(dòng)物，經(jīng)心臟穿刺取血，留血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測BUN含量。取腎組織勻漿，檢測SOD含量，按試劑盒說明進(jìn)行。

1.6 免疫組織化學(xué)染色 采用SP法對四組腎組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色、棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。觀察陽性細(xì)胞染色深淺及染色范圍，判斷ICAM-1的表達(dá)情況。

1.7 Western印跡分析 首先進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和分離，轉(zhuǎn)膜后分別與一抗、二抗反應(yīng)進(jìn)而顯色。運(yùn)用美國Kodak公司黑馬凝膠分析系統(tǒng)軟件對Western印跡結(jié)果進(jìn)行定量分析，采集積分光密度值(IOD)，結(jié)果以目的基因與β-actin的IOD比值表示。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠血清BUN及腎組織勻漿SOD含量比較 各組SOD變化明顯，Ⅱ組較Ⅰ組明顯下降(P＜0.05)，III組較Ⅱ組下降更為明顯(P＜0.05)，后處理組(Ⅳ組)較Ⅱ組低，較III組顯著升高(P＜0.05)。Ⅱ組與Ⅰ組比較BUN含量無顯著差異(P＞0.05)，Ⅲ組BUN水平明顯升高，后處理組相應(yīng)下降，與Ⅲ組比較有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

表1 大鼠血清BUN及腎組織SOD含量比較(±s)

表1 大鼠血清BUN及腎組織SOD含量比較(±s)

與Ⅱ組比較:1)P＜0.05;與Ⅲ組比較:2)P＜0.05

組別 n BUN(mmol/L) SOD(U/mg.pro)Ⅰ組 6 2.08±0.49 22.58±1.791)Ⅱ組 6 2.16±0.57 19.03±1.90Ⅲ組 6 10.30±1.971) 11.92±1.171)Ⅳ組 6 4.92±0.922) 15.95±0.791)2)

2.2 各組腎組織免疫組化染色結(jié)果 I組腎小管上皮細(xì)胞未見陽性產(chǎn)物，Ⅱ組可見腎小管上皮細(xì)胞少量細(xì)顆粒棕色產(chǎn)物，Ⅲ組可見腎小管上皮細(xì)胞大量深棕色顆粒狀陽性產(chǎn)物，Ⅳ組可見陽性產(chǎn)物表達(dá)減輕呈灶性分布。見圖1。

2.3 Western印跡檢測結(jié)果 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組ICAM-1蛋白表達(dá)水平較Ⅰ組均有增加，以Ⅲ組最高，與Ⅰ組比較有顯著性差異(P＜0.05)，Ⅳ組與Ⅲ組比較亦有顯著性差異(P＜0.05)。見圖2。

圖1 各組大鼠腎組織ICAM-1表達(dá)(SP，×200)

圖2 各組腎組織中ICAM-1蛋白表達(dá)的Western印跡分析

3 討論

肢體IRI后繼發(fā)的腎損傷發(fā)生機(jī)制復(fù)雜。有研究認(rèn)為，腎損傷的主要發(fā)病原因是腎小管內(nèi)形成的肌紅蛋白管型堵塞腎小管所致。隨著目前研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)由肌紅蛋白在酸性環(huán)境下(pH＜5.6)解離出亞鐵血紅素的作用更為重要，它可通過脂質(zhì)過氧化作用使自由基增多，從而直接損傷腎小管上皮細(xì)胞〔3〕。過多的自由基可直接損傷腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，使腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，最終腎小球?yàn)V過率下降導(dǎo)致急性腎衰竭〔4〕;同時(shí)氧自由基還可激活核因子-κB信號傳導(dǎo)通路，造成細(xì)胞因子、黏附分子等過度表達(dá)。ICAM-1屬免疫球蛋白超家族成員，介導(dǎo)白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附以及白細(xì)胞穿過血管壁的過程，在IRI中同樣起著重要的作用。由ICAM-1介導(dǎo)的白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互黏附是白細(xì)胞聚集、活化和釋放炎性介質(zhì)的關(guān)鍵〔5，6〕。SOD是一種天然的抗氧化酶，是清除體內(nèi)氧自由基的最主要成分。IRI時(shí)，由于氧自由基生成增多，SOD被大量消耗，因此SOD的增多是體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生減少的有力佐證。本實(shí)驗(yàn)中IRI組BUN明顯增高，SOD顯著下降，腎損傷程度加重，ICAM-1表達(dá)增強(qiáng)，說明了氧自由基及ICAM-1參與了骨骼肌缺血再灌注腎損傷。因此，對抗氧自由基產(chǎn)生并抑制炎性細(xì)胞向組織浸潤，是防止IRI較為有效的方法。

缺血后處理是組織缺血后再灌注前給予短時(shí)間多次重復(fù)灌注-停灌處理后，繼續(xù)再灌注的一種處理方式，是近年來提出的通過調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制減輕組織器官IRI的新措施。本實(shí)驗(yàn)中，與缺血再灌注組比較，缺血后處理組SOD明顯增加，BUN顯著下降，結(jié)合腎組織中ICAM-1蛋白的檢測結(jié)果，說明缺血后處理可以明顯減少自由基的產(chǎn)生及炎性細(xì)胞浸潤，對骨骼肌缺血再灌注腎損傷具有保護(hù)作用。有關(guān)缺血后處理阻斷ICAM-1及氧自由基產(chǎn)生的具體途徑仍有待進(jìn)一步研究。

1 孫海波，魏俊強(qiáng)，潘進(jìn)社.骨骼肌缺血再灌注損傷中自由基的產(chǎn)生機(jī)制及治療研究進(jìn)展〔J〕.中國矯形外科雜志，2011;19(4):305-7.

2 張連元，楊 林.生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)教程〔M〕.北京:人民軍醫(yī)出版社，2001:29-30.

3 王 鋒，晏春根，汪年松，等.肌紅蛋白尿性急性腎衰竭12例診斷與治療〔J〕.中國全科醫(yī)學(xué)，2004;11(7):1601-4.

4 Rubinstein I，Abassi Z，Milman F，et al.Hyperbaric oxygen treatment improves GFR in rats with ischemia/reperfusion renal injury:a possible role for the antioxidant/oxidant balance in the ischemic kidney〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2009;24(2):428-36.

5 Patel NS，Chatterie PK，Mazzon E，et al.Endogenous interleukin-6 enhances the renal injury，dysfunction，and inflammation caused by ischemia-reperfusion〔J〕.JPharmacol Exp Ther，2005;312(3):1170-8.

6 夏 康，李家兵，吳建偉，等.丹紅注射液對大鼠移植腎缺血再灌注損傷后ICAM-1表達(dá)的影響〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010;35(2):199-201.