羅 強 孫 黎 張 力 劉 華 劉開揚 (河北北方學(xué)院實驗中心，河北 張家口 075000)

結(jié)腸癌是常見惡性腫瘤，我國是結(jié)腸癌的高發(fā)國家。隨著經(jīng)濟發(fā)展，生活方式的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病日漸增多。在發(fā)病率上升的同時，結(jié)腸癌發(fā)病年齡趨向老齡化〔1，2〕。老年結(jié)腸癌在臨床、病理特征、治療及預(yù)后等方面與中青年有所不同，如:癥狀隱匿，發(fā)展較慢，惡性度較低、誤診率高，并發(fā)癥較多，術(shù)后并發(fā)癥常見，直接影響老年結(jié)腸癌的治療和預(yù)后。老年結(jié)腸癌是臨床非常常見的惡性腫瘤，近年發(fā)病率有進一步升高。有研究表明〔3～5〕，姜黃素能抑制多種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞如食道癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌和腎癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長及增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但姜黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞上述方面作用的研究報道較少。本研究主要通過姜黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖凋亡作用來探討抗腫瘤效應(yīng)可能與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。從分子生物學(xué)水平揭示作用機制，為姜黃素進一步研究開發(fā)及臨床治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器 人結(jié)腸癌細(xì)胞株(SW620)由河北醫(yī)科大學(xué)惠贈。無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基(RPMI1640)(Gibco公司)，胎牛血清(天津市川頁生化制品有限公司)，CCK-8(上海同仁化學(xué))，碘化丙啶(PI)(深圳晶美生物工程有限公司);異硫氰酸熒光素(FITC-p53)、PE-bcl-2(美國BD公司)。美國Spectra-Max M2e多功能微孔板檢測系統(tǒng)，美國FACSA ria流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

1.2.1 SW620細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用不同濃度姜黃素處理。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制 取對數(shù)生長期的SW620細(xì)胞5×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，100μl/孔。用RPMI1640培養(yǎng)液將姜黃素稀釋成 5個不同濃度(0.25，0.5，0.75，1.0，1.2 mmol/L)，分別加入96孔培養(yǎng)板(100μl/孔)，每組設(shè)4個復(fù)孔，對照組加入等體積培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。然后每孔加入CCK-8 20μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后用 SpectraMax M2/M2e多功能微孔板檢測系統(tǒng)測吸光度(A490值)，按公式計算細(xì)胞抑制率:抑制率(%)=(1-實驗組平均A490值/對照組平均A490值)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將培養(yǎng)至對數(shù)生長期密度為1×106/ml SW620細(xì)胞分別接種于6個50 ml的培養(yǎng)瓶，1.5 ml/瓶，待細(xì)胞貼壁后，分別加入上述5個不同濃度的姜黃素懸液1.5 ml，對照組加入1.5 ml培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，1 500 r/min，離心7 min收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)洗滌3次，最后1次移入1 ml離心管中，PI染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測p53，bcl-2蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期SW620細(xì)胞(密度為1×106/ml)分別接種于4個50 ml的培養(yǎng)瓶中，貼壁后換不同濃度的姜黃素培養(yǎng)液(0.25，0.5，0.75 mmol/L)，對照組加入等量培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，分別加入20μl FITC-p53及PE-bcl-2孵育20 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對SW620細(xì)胞增殖的影響 CCK-8法檢測0.25，0.5，0.75，1.0，1.2 mmol/L 5個不同濃度的姜黃素作用 SW620細(xì)胞24 h，對SW620細(xì)胞的生長均得到明顯的抑制，并且隨著藥物濃度增加，對SW620細(xì)胞抑制率增加且生存率下降，分別為 19.05%、28.13%、40.95%、43.81%、51.43%;80.95%、71.87%、59.05%、56.19%、48.57%。與對照組相比差異均有顯著性(P＜0.01)。

2.2 姜黃素對SW620細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)不同濃度姜黃素處理的SW620細(xì)胞，均出現(xiàn)一個亞二倍體的凋亡峰，其峰值(即凋亡細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值)隨姜黃素濃度增高逐漸增高。其峰值分別為5.53%、7.12%、10.34%、21.14%及29.68%。對照組無亞二倍體凋亡峰，見圖1，圖2。

2.3 姜黃素對SW620細(xì)胞p53和bcl-2表達(dá)的影響 經(jīng)0.25，0.5，0.75 mmol/L 3個不同濃度的姜黃素作用SW620細(xì)胞24 h后，與對照組相比，p53表達(dá)明顯增高，bcl-2表達(dá)顯著降低，用藥前后均有顯助性差異，且姜黃素對SW620細(xì)胞的作用呈劑量依賴性。見表1。

圖1 對照組流式檢測結(jié)果

圖2 0.75 mmol/L姜黃素組流式檢測結(jié)果(↘為凋亡峰)

表1 姜黃素對SW620細(xì)胞p53和bcl-2蛋白表達(dá)的影響(%)

3 討論

姜黃是一種常見的中藥〔6〕，從姜黃中提取的酚性色素姜黃素是姜黃的主要有效成分，具有多方面的藥理作用，有消炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、降血脂等作用〔7〕。姜黃素的抗癌機制是多方面的，其中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制受到人們的廣泛關(guān)注。姜黃素可以抑制P-糖蛋白的功能和表達(dá)，激活半胱天冬酶-3，對多藥耐藥性人類胃癌細(xì)胞系(SGC7901)/長春新堿(VCR)起逆轉(zhuǎn)作用〔8〕，孫軍等〔9〕通過姜黃素作用于人肝癌細(xì)胞株(BEL-7402)的實驗研究證實，姜黃素可通過蛋白酶體途徑減少人肝癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)蛋白的表達(dá)。研究表明，姜黃素可以上調(diào)p53絲氨酸磷酸化和Bax的水平，同時下調(diào)Bcl-2、半胱天冬酶前體-3(pro-caspase-3)和半胱氨酸前體-9(pro-caspase-9)的水平，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)的凋亡，提示其可作為一種有效的治療結(jié)腸癌的藥物〔10〕。

CCK-8法檢測5個不同濃度的姜黃素作用SW620細(xì)胞24 h，對SW620細(xì)胞的生長有不同程度的抑制作用，并且隨著藥物濃度增加，對SW620細(xì)胞抑制率也增加、生存率下降。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡的處罰是一個有多基因參與的級聯(lián)式表達(dá)結(jié)果，藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡受一個或多個基因的調(diào)控。癌基因在正常細(xì)胞就存在，且在生理狀態(tài)下參與細(xì)胞的正常生長、分化及代謝過程。抑癌基因是一列可以抑制細(xì)胞生長并能潛在抑制癌變的基因〔11〕。癌基因與抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，癌基因增強細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，抑癌基因誘導(dǎo)凋亡清除癌變細(xì)胞，凋亡基因和抑癌基因廣泛用于癌癥的基因治療〔12〕。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明姜黃素具有上調(diào)抑癌基因p53的表達(dá)，下調(diào)癌基因bcl-2的表達(dá)作用，而誘發(fā)SW620細(xì)胞凋亡。

1 李連弟，魯鳳珠，張思維，等.中國惡性腫瘤死亡率20年變化趨勢和近期預(yù)測分析〔J〕.中華腫瘤雜志，1997;19(1):3-9.

2 席亞鳴.結(jié)腸癌的治療進展〔J〕.腹部外科，2000;13(2):120-8.

3 Ushida J，Sugie S，Kawabata K，et al.Chemopreventive effect of curcumin on N-nitrosomethylbenzylamine-induced esophageal carcinogenesis in rats〔J〕.Jpn J Cancer Res，2000;91(9):893-8.

4 Inano H，Onoda M，Inafuku N，et al.Potent preventive action of curcumin on radiation induced initiation of mammary tumorigenesis in rats〔J〕.Carcinogenesis，2000;21(10):1835-41.

5 Busquets S，Carbo N，Almendro V，et al.Curcumin，a natural product present in turmeric，decreases tumor growth but does not behave as an anticachectic compound in a rat model〔J〕.Cancer Lett，2001;167(1):33-8.

6 黃映紅，劉曉城，黃征宇，等.姜黃素對大鼠糖尿病腎的實驗研究〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2004;14(7):94-7.

7 Araujo CC，Leon LL.Biological activities of Curcuma longa L〔J〕.Mem Inst Oswaldo Cruz，2001;96(5):723-8.

8 Tong QS，Zheng LD，Lu P，et al.Apoptosis-inducing effects of curcumin derivatives in human bladder cancer cells〔J〕.Anti Cancer Drugs，2006;17(3):279-87.

9 孫 軍，李 巖.姜黃素對人肝癌細(xì)胞BEL-7402中HIF-1α表達(dá)的影響〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2006;22(11):1379-83.

10 Song G，Mao YB，Cai QF，et al.Curcumin induces human HT-29 colon adenocarcinoma cell apoptosis by activating p53 and regulating apoptosis-related protein expression〔J〕.Braz JMed Biol Res，2005;38(12):1791-8.

11 李 鵬，李祺福，黃胤怡.腫瘤治療的新途徑-中藥有效成分誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞分化〔J〕.生物學(xué)通報，2002;37(3):8-11.

12 EI-Aneed A.Current strategies in cancer gene therapy〔J〕.Eur J Pharmacol，2004;498(1-3):1-8.