劉鶴松 王 芳 吳 杰 趙自然 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科，吉林 長春 130021)

病理性瘢痕(Pathological Scar，PS)是整形外科研究的重點(diǎn)及難點(diǎn)，隨著對其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在病理性瘢痕形成中起著重要的作用。人參皂苷Rg3(GSRg3)是從人參中分離提純的一種單體，為四環(huán)三萜類人參二醇型皂苷〔1〕。目前國內(nèi)外關(guān)于GS-Rg3的研究主要是針對腫瘤的治療，大量研究表明GS-Rg3能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并抑制其轉(zhuǎn)移。最近研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3、細(xì)胞色素C對細(xì)胞凋亡的形成起重要作用，與瘢痕增生密切相關(guān)〔2，3〕。本實(shí)驗(yàn)通過建立兔耳增生性瘢痕模型，研究GS-Rg3對兔耳增生性瘢痕Caspase-3、細(xì)胞色素C的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 大耳白兔24只，雌雄不拘，體重(2.5±0.2)kg，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。根據(jù)時(shí)間分為2 w、4 w、6 w實(shí)驗(yàn)組三組及對照組。

1.2 主要儀器及試劑 主要儀器:高精度輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)，購自日本的LAICA。電熱恒溫干燥箱購自中國上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠。石蠟包埋機(jī)、恒溫孵化箱購自日本的SANYO。顯微鏡購自日本的OLYMPUS。CO2孵箱購自美國SHEL LAB;酶標(biāo)儀購自美國BIO-RAD。免疫組化試劑盒、DAB顯示試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。主要試劑:GS-Rg3來自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH6.0)、0.01 mol/L(pH7.4)的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)為吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院配制。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的制備 用速眠新注射液0.2～0.3 ml/kg肌肉注射。麻醉生效后，消毒兔耳腹面皮膚，切除2 cm×2 cm的全層皮膚，每耳4～6處。將動物編號，分籠飼養(yǎng)。3 w后創(chuàng)面形成凸起的增生性瘢痕組織。于四組動物耳部增生性瘢痕組織處行局部封閉注射，實(shí)驗(yàn)組注射GS-Rg3(濃度6 mg/2 ml)，對照組注射等體積的0.9%生理鹽水，三天一次。分別于用藥后2 w、4 w、6 w切取瘢痕組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定48～72 h，石蠟包埋切片。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 瘢痕組織立刻經(jīng)4%多聚甲醛-0.01 mol/L PBS(pH7.4)固定。6 h后，PBS漂洗4～5 h，每小時(shí)交換洗液，或4℃冰箱過夜。乙醇常規(guī)脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋。用石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，每片標(biāo)本4μm厚，HE染色、免疫組化法中的鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶連接法(SP法)染色。PBS為陰性對照。免疫組化染色陽性結(jié)果為棕黃色或棕黑色顆粒。每例切片隨機(jī)選擇五個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算五個(gè)視野的平均陽性率。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組與對照組相比Caspase-3的表達(dá)在用藥后6 w增加至2.4倍。實(shí)驗(yàn)組與對照組相比細(xì)胞色素C的表達(dá)在用藥后6 w增加至2.8倍。增生性瘢痕用藥前后細(xì)胞色素C、Caspase-3陽性細(xì)胞率見表1，圖1。

表1 增生性瘢痕用藥前后細(xì)胞色素C、Caspase-3陽性細(xì)胞率比較(%，±s)

表1 增生性瘢痕用藥前后細(xì)胞色素C、Caspase-3陽性細(xì)胞率比較(%，±s)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

24 8.11±4.23 7.93±4.51實(shí)驗(yàn)組2 w 24 13.05±4.941) 11.33±3.482)實(shí)驗(yàn)組4 w 24 18.66±5.092) 15.82±4.762)實(shí)驗(yàn)組6 w 24 23.13±5.762) 19.28±4.052)Caspase-3對照組時(shí)間 n 細(xì)胞色素C

圖1 增生性瘢痕中細(xì)胞色素C、Caspase-3陽性表達(dá)(免疫組化SP法，×40)

3 討論

瘢痕是創(chuàng)傷愈合的必然產(chǎn)物，但是過度的瘢痕增生不僅影響美觀，嚴(yán)重時(shí)可引起組織器官功能障礙，因此成為創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。研究主要集中在成纖維細(xì)胞的增殖與凋亡、膠原的合成與降解、細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。其中細(xì)胞凋亡研究備受關(guān)注，細(xì)胞凋亡不僅參與正常創(chuàng)傷愈合的組織重建，而且與增生性瘢痕的形成、消退密切相關(guān);凋亡不足亦是引起增生性瘢痕的原因之一。GS-Rg3是從人參中提取的單體，為四環(huán)三萜類人參二醇型皂苷。目前國內(nèi)外關(guān)于GS-Rg3的研究主要針對腫瘤的治療，治療瘢痕的報(bào)道較少。

Caspases是一種半胱氨酸蛋白酶，而且具有天門冬氨酸的活性，是白細(xì)胞介素1-β轉(zhuǎn)化酶家族(ICE/CED-3)中的重要成員。它是一組與線蟲CED-3同源的調(diào)控哺乳動物細(xì)胞凋亡、具有14個(gè)成員的蛋白酶家族〔4〕，對細(xì)胞凋亡的形成起重要作用。凋亡發(fā)生機(jī)制中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一是Caspase的激活。Caspase蛋白家族以非活性的前體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)被切斷后才成為活性蛋白酶。近年來，許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞色素C可激活Caspase。Caspase-3屬于Caspase超家族成員，在細(xì)胞凋亡過程中起著非常重要的作用。細(xì)胞色素C在細(xì)胞凋亡中的作用近幾年來才引起人們的注意。細(xì)胞色素C是線粒體呼吸鏈中的一個(gè)基本成分，通過抵抗多種形式的細(xì)胞死亡而延長細(xì)胞壽命，使細(xì)胞數(shù)目累積增多，參與細(xì)胞增殖與凋亡動態(tài)平衡的調(diào)控。細(xì)胞色素C是一種可溶性蛋白，正常位于線粒體膜內(nèi)，并松散地附著于線粒體膜的內(nèi)表面。當(dāng)細(xì)胞色素C從細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)移到胞漿，一旦胞質(zhì)中出現(xiàn)細(xì)胞色素C，其可與細(xì)胞質(zhì)中的其他成分相互作用，激活Caspase，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)利用免疫組化方法檢測增生性瘢痕中Caspase-3及細(xì)胞色素 C表達(dá)，結(jié)果顯示:GS-Rg3可明顯增加細(xì)胞質(zhì)中Caspase-3及細(xì)胞色素C表達(dá)，與對照組相比用藥后6 w分別增加至2.4倍及2.8倍。表明GS-Rg3先導(dǎo)致線粒體細(xì)胞色素C釋放量增加，然后激活Caspase耦聯(lián)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。最近也有研究發(fā)現(xiàn)人的增生性瘢痕組織中Caspase-3蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡受阻。所有這些發(fā)現(xiàn)更進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞色素C和Caspase的激活在增生性瘢痕治療中的作用。Zhivotovsky等采用顯微注射的方法將細(xì)胞色素C注入到腫瘤細(xì)胞、大鼠上皮細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，也可導(dǎo)致這些細(xì)胞發(fā)生凋亡。若先將這些細(xì)胞與Caspase抑制劑孵育一段時(shí)間后，再注入細(xì)胞色素C于胞漿中，則幾乎不會發(fā)生細(xì)胞凋亡，說明細(xì)胞色素C的作用依賴于Caspase，它通過激活Caspase而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡〔5〕。

Caspase正常情況下以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，這種非活性形式可被蛋白水解酶切斷而激活。由線粒體內(nèi)膜釋放到細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C作為輔助因子參與Caspase-3的激活;Caspase-3活化后，識別并降解其底物，使得一些處于靜止?fàn)顟B(tài)的促凋亡因子被激活，Caspase可截?cái)嗟蛲黾?xì)胞與周圍細(xì)胞的聯(lián)系，破壞重組細(xì)胞骨架，阻止DNA復(fù)制和修復(fù)，干擾DNA、RNA的拼接，破壞核結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞出現(xiàn)吞噬的信號，使細(xì)胞成分降解并形成凋亡小體，一些與DNA損傷修復(fù)、RNA剪切、DNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白因子被裂解失活〔6，7〕。因此Caspase-3一經(jīng)激活并導(dǎo)致底物裂解，細(xì)胞凋亡將不可逆地進(jìn)行下去。

綜上所述，增生性瘢痕的形成受到多種因素的影響，可能是多個(gè)基因與外源性因素共同作用的結(jié)果，GS-Rg3可明顯上調(diào)Caspase-3及細(xì)胞色素C的表達(dá)，能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡。

1 王本祥.人參研究進(jìn)展〔M〕.天津:科學(xué)技術(shù)出版社，1991:97-9，125-53.

2 竇德強(qiáng)，靳 玲，陳英杰.人參的化學(xué)成分及藥理活性的研究進(jìn)展與展望〔J〕.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999;16(4):151-6.

3 王鴻彪，林英城.人參皂苷Rg3抗腫瘤作用研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2009;15(3):323.

4 Yuan J，Shaham S，Ledoux S，et al.The C.elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme〔J〕.Cell，1993;75(4):641.

5 Wassermann RJ，Polo M，Smith P，et al.Differential production of apoptosis-modulating proteins in patients with hypertrophic burn scar〔J〕.J Sur Res，1998;75(1):74.

6 Enarl M，Talanian RV，Wong WW，et al.Sequential activation of ICE-like and CPP32-like proteases during Fas-mediated apoptosis〔J〕.Nature，1996;380(4):723.

7 Akasaka Y，Ishikawa Y，Ono I，et al.Enhanced expression of caspase-3 in hypertrophic scars and keloid:induction of caspase-3 and apoptosis in keloid fibroblasts in vitro〔J〕.Lab Invest，2000;80(2):34.