蘇 偉 高 楓 龔少愚 魏慧淵 孫茂民 江家貴 (南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院，江蘇 無錫 2400)

硫氧還蛋白(TRX)是一類分布廣泛的小分子多功能蛋白，在細(xì)胞內(nèi)行使著各種不同的功能〔1〕。TRX與其還原酶及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(NADPH)構(gòu)成的氧化還原系統(tǒng)介導(dǎo)氫的傳遞，亦可單獨(dú)作為蛋白質(zhì)二硫鍵氧化還原發(fā)揮作用，對許多蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)〔2，3〕。TRX有強(qiáng)烈的清除體內(nèi)過氧化物的功能，在機(jī)體抗氧化過程中起著重要的作用〔4，5〕，對防止心腦器官缺血再灌注損傷性有重要作用〔6〕。人TRX(human thioredoxin，hTRX)基因定位于3p12-p11，基因全長13 kb，其保守區(qū)為318 bp，開放閱讀框架編碼了含104個(gè)氨基酸組成蛋白質(zhì)〔7，8〕。為探討hTRX基因的生物學(xué)活性及其在內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中的作用，本文擬克隆并構(gòu)建hTRX的真核表達(dá)載體，為后續(xù)研究的開展提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 RNA抽提試劑盒、TaqDNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶 EcoR I、BamH I、dNTPs、MgCl2均購自大連寶生物工程公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑、pcDNA3.0質(zhì)粒購自上海申能博彩生物科技制品有限公司。DH5α菌株由本室保存，pUCm-T Vector載體試劑盒購自Promega公司。正常人胎肝取自水囊引產(chǎn)之胎兒(4月齡)。中國人民解放軍蘇州100醫(yī)院婦產(chǎn)科。hTRX引物P1:5'-CGGAATTCATGGTGAAGCAGATCGAGAGC-3'，P2:5'-CGGGATCCGATTAGACTAATTCATTAATG-3'。上游引物5'端設(shè)有DNA限制酶(EcoRⅠ)酶切位點(diǎn)，下游引物:5'端含限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ(BamHⅠ)酶切位點(diǎn)。引物參考GenBank的hTRX基因序列(J04026)設(shè)計(jì)，由上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR擴(kuò)增hTRX cDNA ①取胎兒肝組織約150 mg，參照RNA抽提試劑盒手冊進(jìn)行總RNA的提取。②取3 μl總 RNA，15 mmol/L Oligo(dT)18 加入 2 μl，65℃ 作用5 min;然后加入5×RT緩沖液4μl，10 mmol/L dNTPs 2μl和0.5μl RNA酶抑制劑，1μl逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶，最后加雙蒸水至總體積為20μl，置37℃水浴1 h，90℃處理10 min后，獲得cDNA模板。③ 取 cDNA 模板2μl，P11μl，P21μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，10 × Reaction Buffer 5 μl，MgCl23 μl，TaqDNA 聚合酶1 μl，dd H2O 35 μl，擴(kuò)增體積為 50 μl，置 PCR儀中擴(kuò)增。首先94℃ 3 min預(yù)變性，然后進(jìn)行下列循環(huán):94℃45 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，共 32 個(gè)循環(huán)，最后 72℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 重組pUCm-T/hTRX質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將hTRX cDNA與pUCm-T載體進(jìn)行體外連接(參照Promega公司T載體系統(tǒng)說明書進(jìn)行)，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，用抗性篩選法挑選陽性菌落并進(jìn)行測序，取測序正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增。

制備DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并轉(zhuǎn)化。過程如下:①取活化的DH5α按1%接種入30 ml LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，至OD值為0.3左右。②倒入50 ml離心管中0℃，10 min?！?℃，5 000 r/min，離心 5 min?！鷹壣锨?，振松菌塊，加入 8 ml 100 mmol/L預(yù)冷 CaCl2，0℃，30 min?！?℃，5 000 r/min，離心5 min?！鷹壣锨?，振松菌塊，加入200μl 100 mmol/L預(yù)冷CaCl2。③按下表進(jìn)行轉(zhuǎn)化:

表1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及分組

④0℃，30 min?！?42℃，90 s?！?℃，2 min?！?加37℃預(yù)熱的LB 1 ml?！?7℃，45 min搖動震蕩培養(yǎng)。⑤5 000 r/min，離心5 min，棄上清。留100μl混懸液分別涂布平板，37℃置隔水式恒溫培養(yǎng)箱。⑥待實(shí)驗(yàn)組平板有藍(lán)白菌落生長時(shí)，從中挑取白色單菌落接種于5 ml 1%LB中，37℃，震蕩培養(yǎng)過夜。⑦用V-gene公司質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒。

1.2.3 hTRX克隆基因序列分析 以陽性克隆重組質(zhì)粒cDNA為模板，選擇T7測序引物，雙脫氧終止法測定克隆基因序列。

1.2.4 pcDNA3.0/hTRX真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切經(jīng)測序驗(yàn)證的pUCm-T/hTRX質(zhì)粒DNA，回收目的hTRX cDNA基因片段，將其定向克隆至經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切的pcDNA3.0真核表達(dá)質(zhì)粒上，以常規(guī)氯化鈣法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用PCR和雙酶切分析法鑒定重組子。雙酶切反應(yīng):體系①pMD18-T 10 μl，10 ×Buffer 5 μl，EcoRⅠ 0.9 μl，BamHⅠ 0.7 μl，ddH2O 33.4 μl共 50 μl。②pcDNA3.0 10 μl，10× Buffer 5 μl，EcoR Ⅰ 1.0 μl，BamH Ⅰ 0.8 μl，ddH2O 31.2μl，共50μl。在37℃作用3～5 h，隨后進(jìn)行核酸瓊脂糖電泳，用V-Gene公司膠回收試劑盒分別回收hTRX cDNA片段和pcDNA3.0載體分別經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后用于連接反應(yīng)?；蛑亟M連接反應(yīng)體系:hTRX cDNA片段3μl，雙酶切的pcDNA3.0 1.5 μl，10 × Buffer 1 μl，T4 DNA 連接酶 0.8 μl，ddH2O 3.7 μl，共10 μl，16℃ ～18℃連接過夜，以備轉(zhuǎn)化。后續(xù)的轉(zhuǎn)化、酶切及PCR鑒定方法同hTRX克隆載體部分相同。

1.2.5 pcDNA3.0-hTRX轉(zhuǎn)染非州青猴腎細(xì)胞(COS-7)細(xì)胞

接種COS-7細(xì)胞于6孔板，3×106個(gè)細(xì)胞/孔，37℃，5%CO2條件下孵育18～24 h至60% ～80%融合度，然后用無血清DMEM將上述貼壁COS-7細(xì)胞洗1～2次，加入預(yù)先混合30 min的溶液 A:pcDNA3-ING4 6 μl、DMEM 94 μl;B:Lipofectamine 8 μl、DMEM 92 μl。于37℃、5%CO2條件下孵育5 h，補(bǔ)加1 ml DMEM含20%胎牛血清(FCS)/孔，繼續(xù)孵育18～24 h，換液為DMEM(10%FCS)，37℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h后收集COS-7細(xì)胞(4℃保存?zhèn)溆?，同時(shí)以同樣的方法將pcDNA3.0空載體轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞作空白對照。

1.2.6 COS-7細(xì)胞中hTRX mRNA的檢測 轉(zhuǎn)染72 h后，分別收集實(shí)驗(yàn)組hTRX基因重組質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞，Trizol提取細(xì)胞總RNA，以此RNA為模板按常規(guī)法合成cDNA第一鏈，用上述引物的常規(guī)PCR法擴(kuò)增hTRX編碼區(qū)cDNA。具體反應(yīng)條件為 94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，熱循環(huán)32次，最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增hTRX基因 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，顯示為一約335 bp的片段，與理論預(yù)測結(jié)果相符。見圖1。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析

2.2 重組質(zhì)粒pUCm-T/hTRX的鑒定 pUCm-T/hTRX質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶(EcoRⅠ、BamHⅠ)切法鑒定均出現(xiàn)335 bp大小的條帶，表明重組載體構(gòu)建正確。見圖2。

2.3 擴(kuò)增hTRX基因測序與分析 測序結(jié)果與已發(fā)表的序列和基因庫數(shù)據(jù)相比完全一致。

2.4 重組真核表達(dá)載體pcDNA3.0/hTRX的鑒定 pcDNA3.0/hTRX經(jīng)PCR和雙酶切(EcoRⅠ、BamHⅠ)鑒定均出現(xiàn)了335 bp大小的條帶，測序結(jié)果同克隆測序結(jié)果，表明真核表達(dá)載體構(gòu)建正確。見圖3。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定

2.5 hTRX基因在轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞中的表達(dá)檢測 經(jīng)RT-PCR檢測證實(shí)hTRX基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)有hTRX mRNA表達(dá)，而轉(zhuǎn)染空白載體pcDNA3.0的細(xì)胞內(nèi)無hTRX mRNA表達(dá)。見圖4。

圖3 重組真核表達(dá)載體的PCR及酶切鑒定

圖4 RT-PCR鑒定hTRX mRNA

3 討論

Wollman等首次從3B6EB病毒轉(zhuǎn)化的人淋巴母細(xì)胞B細(xì)胞(3B6 Human EBV Lymphoblastoid B Cell Line)克隆hTRX基因全長cDNA序列。Kaghad等從λEMBL4嗜菌體人類基因文庫中分離出hTRX全長cDNA片段。hTRX基因長達(dá)13 kb并含有5個(gè)外顯子被4個(gè)內(nèi)含子分開，編碼12 kD的蛋白質(zhì)。Southern分析表明在人類基因組中存在幾種hTRX基因，但至少其中之一是無活性的假基因〔7〕。同植物和細(xì)菌的 TRX一樣，hTRX具有高度保守的酶活性中心:Trp-Cys-Gly-Pro-Cys?；钚灾行牡亩€基可被可逆的氧化形成二硫鍵，并可通過這個(gè)過程來控制靶蛋白中二硫鍵或二巰基的形成，調(diào)控靶蛋白的活性與功能。研究發(fā)現(xiàn)，其活性部位CXXC存在于許多具有類似活性的蛋白質(zhì)中〔8，9〕，但是，hTRX與大腸桿菌TRX的活性中心不同，其活性中心還有另外的三個(gè)半胱氨酸，該結(jié)構(gòu)賦予hTRX獨(dú)特的生物活性。已證實(shí)成人T白血病細(xì)胞的自分泌生長因子——成人T細(xì)胞衍生因子(ADF)即為hTRX。

因?yàn)閙RNA編碼hTRX在細(xì)胞分裂活躍的組織中高表達(dá)，所以，以胎肝細(xì)胞RNA為模板，根據(jù)hTRX基因已知序列設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR方法擴(kuò)增出hTRX成熟蛋白基因片段。經(jīng)克隆后測序分析比較，結(jié)果與Gasdaska等從HT 29結(jié)腸癌肉瘤細(xì)胞、Lalop EB病毒轉(zhuǎn)換化的人淋巴母細(xì)胞(Lalop Human EBV Lymphoblastoid Cell Line)和正常人肝組織提取的hTRX cDNA序列完全相同?？寺⌒蛄信cGenbank提供的hTRX cDNA序列完全相同。王應(yīng)等通過對從人胚肝細(xì)胞來源的hTRX c DNA序列分析，發(fā)現(xiàn)其只包含了hTRX的第1，2，4，5個(gè)外顯子，第3個(gè)外顯子(60 bp)被完整地剪切掉，其他核酸序列及另外六種模板來源的hTRX cDNA序列與Genbank提供的相同〔10〕。編碼hTRX成熟蛋白的cDNA基因的克隆成功，為進(jìn)一步研究其功能活性提供了條件。

真核表達(dá)載體是基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的理想載體，陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法又以其轉(zhuǎn)染效率高、無免疫原性、整合和擴(kuò)散性小、操作簡便、容量大而受到國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了hTRX真核表達(dá)載體，經(jīng)PCR、雙酶切和基因測序結(jié)果均表明重組載體pcDNA3.0/hTRX構(gòu)建正確，為進(jìn)一步研究hTRX基礎(chǔ)。

作為一種真核瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，COS-7細(xì)胞是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的有利工具，多種載體可在COS-7細(xì)胞中表達(dá)外源基因〔11〕。本文采用成功構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.0/hTRX轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞系COS-7對hTRX基因的真核表達(dá)進(jìn)行了初步研究。RT-PCR檢測證實(shí)hTRX基因至少在轉(zhuǎn)錄水平上有表達(dá)。為進(jìn)一步pcDNA3.0-hTRX轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，探討hTRX基因的生物學(xué)活性及其在內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 Kamata H，Hirata H.Redox Regulation of celluar signalling〔J〕.Cell Signal，1999;11(1):1-14.

2 Hirota K，Nlatsui M，Murata M.Nucleoredoxin，glutaredoxin，and thioredoxin differentially regulate NF-kappaB，AP-1，and CREB activation in HEK293 cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2000;274(1):177-82.

3 Baker A，Payne CM，Briehl MM，et al.Thioredoxin，a gene found overexpressed in human cancer，inhibits apoptosis in vitro and invivo〔J〕.Cancer Res，1997;57(22):5162-7.

4 Kim YC，Masutani H，Yamaguchi Y，et al.Hemin-induced activation of the thioredoxin gene by Nrf2〔J〕.J Biol Chem，2001;276(21):18399-406.

5 Sano H，Sata T，Nanri H，et al.Thioredoxin is associated with endotoxin tolerance in mice〔J〕.Crit Care Med，2002;30(1):190-4.

6 Takagi Y，Mitsui A，Nishiyama A，et al.Overexpression of thioredoxin in transgenic mice attenuates focal ischemic brain damage〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96(7):4131-6.

7 Tonissen KF，Wells JR.Isolation and characterization of human thioredoxin-encoding genes〔J〕.Genes，1991;102(2):221-8.

8 Nigam SK，Goldberg AL，Ho S，et al.A set of endoplasmic reticulum proteins possessing properties of molecular chaperones includes Ca2+binding proteins and members of the thioredoxin superfamily〔J〕.JBio Chem，1994;269(3):1744-9.

9 Gasdaska PY，Oblong JE，Cotgreave IA，et al.The predicted amino acid sequence of human thioredoxin is identical to that of the autocrine growth factor human adult T-cell derived factor(ADF):thioredoxin mRNA is elevated in some human tumors〔J〕.Biochim Biophys Acta，1994;121(3):292-6.

10 王 應(yīng)，王玉剛，張穎妹，等.人硫氧還蛋白存在不同的選擇性剪切形式〔J〕.科學(xué)通報(bào)，1998;43(1):63-7.

11 Davis L，Kuehl M，Battey J.Basic methods in molecular biology(2nd edition)〔M〕.Norwalk，Connecticut:Appleton＆Lange，1993:237-45.