費(fèi)建明 吳 巖 占鵬飛 李玉峰 王文兵

(1浙江省湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江湖州 313000; 2江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

家蠶 Bm NPV多角體蛋白與大腸桿菌L-天冬酰胺酶Ⅱ的融合表達(dá)

費(fèi)建明1吳 巖2占鵬飛1李玉峰1王文兵2

(1浙江省湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江湖州 313000;2江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

L-天冬酰胺酶是一種重要的蛋白類抗腫瘤藥物,可通過降解 L-天冬酰胺從而抑制腫瘤細(xì)胞中蛋白質(zhì)的正常合成,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。通過基因融合的方法,將大腸桿菌的asp基因在家蠶桿狀病毒中表達(dá),其活性進(jìn)一步提高到 5 940 U/mg,為利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)該蛋白打下了基礎(chǔ)。

家蠶;多角體;L-天冬酰胺酶;大腸桿菌

L-天冬酰胺是蛋白質(zhì)合成必需的氨基酸。腫瘤細(xì)胞中天冬酰胺合成酶(asparagines synthetase,AS)活性非常低,不能有效合成 L-天冬酰胺,需依賴外源 L-天冬酰胺才能生存和復(fù)制。L-天冬酰胺酶(L-asparaginase,L-ASP)可通過降解 L-天冬酰胺從而抑制腫瘤細(xì)胞中蛋白質(zhì)的正常合成,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡［1-3］。L-ASP是一種重要的蛋白類抗腫瘤藥物,在臨床上廣泛用于淋巴瘤和兒童急性淋巴細(xì)胞白血病、黑素肉瘤、胰腺癌及霍金森病等疾病的治療［3-4］。L-天冬酰胺酶Ⅱ的生產(chǎn)大多采用以大腸桿菌為宿主的基因工程菌,存在著發(fā)酵水平低和分離純化步驟繁多等問題［2］,難以廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)通過基因融合的方法,將大腸桿菌的 asp基因在家蠶桿狀病毒中表達(dá),以提高其活性,為利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)該蛋白打下了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和菌株 pFastBac1載體、DH10BacTM、BmN細(xì)胞,由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞研究所桿狀病毒組饋贈(zèng);pFastBacHTb-asp重組載體、大腸桿菌 DH5α、鼠源的單克隆多角體抗體,由江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)組實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 酶和試劑 BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ等限制性內(nèi)切酶,T4 DNA連接酶、質(zhì)粒柱抽試劑盒、膠回收試劑盒等購自 TaKaRa公司;Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑購自 Invitrogen公司;TC-100培養(yǎng)基、FBS等購自GIBCO公司。HRP標(biāo)記的羊抗鼠的 Ig抗體、化學(xué)發(fā)光劑為 Pierce公司產(chǎn)品,Protein Marker為 Fermentas公司產(chǎn)品,Prestained Protein Marker為 BioLab公司產(chǎn)品?；瘜W(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因克隆及序列分析 根據(jù) GenBank中 BmNPV多角體基因(polh)序列,設(shè)計(jì)引物 P1:AGGGA TCCatg ccg aat tat tca tac,P2 :CCGAA TTC ata cgc cgg acc agt gaa(下劃線表示酶切位點(diǎn),以下相同),其中在上下游引物分別引入BamHⅠ和 EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。根據(jù) pFastBacHTb-asp DNA序列設(shè)計(jì)引物,其中在上游引物(P3:GAG GGA TCC GAA AACCTG TAT TTTCAG)引入 EcoRⅠ酶切位點(diǎn),在下游引物(P4:GG AAG CTT TTA GTA CTG ATT GAA GAT CTG CT)引入 HindⅢ酶切位點(diǎn)。將上述擴(kuò)增產(chǎn)物分別與 pMD18-T simple vector連接。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的抽提等基因操作,參照文獻(xiàn)［2］進(jìn)行。酶切鑒定的陽性質(zhì)粒,送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.2 轉(zhuǎn)移載體 pFastBac1-polh-asp的構(gòu)建 由BamHⅠ和 EcoRⅠ雙酶切 pMD18-T-polh,將切下的polh插入至同樣酶切的 pFastBac1,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pFastBac1-polh;然后再將 pMD18-T-tev-asp由 EcoRⅠ和 HindⅢ雙酶切,將切下的 tev-asp插入至由同樣酶切的 pFastBac1-polh中,構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-polh-asp。

1.2.3 轉(zhuǎn)座重組及重組病毒的獲得 將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體 pFastBac1-polh-asp轉(zhuǎn)化 DH10BacTM,涂布于含 K X-gal(1mg/L)、IPTG(0.8mg/L)、慶大霉素(7μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)、四環(huán)素(10μg/m L)的 LB平板,48 h左右挑取白色菌落重新劃線,待長出白色菌落后接種于含相應(yīng)抗生素的 LB培養(yǎng)基中,提取重組 Bacmid DNA,用 M13引物(M 13 Forward(-40):GTTTTC CCA GTC ACG AC,M 13 Reverse:CAGGAA ACA GCT ATG AC)PCR鑒定正確后,得到重組 bacmid-polh-asp。

將提取的重組 Bacmid-polh-asp DNA在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞 BmN,28℃培養(yǎng) 120 h后觀察細(xì)胞中多角體的產(chǎn)生,用 15 mL的離心管收集孔板中含重組桿狀病毒的培養(yǎng)液,1 000 r/min離心5 min以去除細(xì)胞及較大的碎片,收集上清即得到原代重組桿狀病毒 Bac-asp,并再次感染 BmN細(xì)胞,收集病毒液。

1.2.4 Western blot分析 感染的細(xì)胞經(jīng)離心后去上清。用磷酸緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞并再懸浮,再加入等量的 2×SDS凝膠上樣緩沖液,混勻后,于沸水中煮沸,取上清液按文獻(xiàn)［5］進(jìn)行 8%SDSPAGE。將蛋白轉(zhuǎn)印至尼龍膜上,進(jìn)行抗體檢測。

1.2.5 L-天冬酰胺酶Ⅱ活性分析 使用奈氏試劑(the Nessler reagent)來檢測 L-天冬酰胺酶Ⅱ的活性［3］。標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品為己知濃度的硫酸銨。為排除桿狀病毒自身的影響,以 BmBacPAK6為對(duì)照。具體步驟如下:將上述收集的細(xì)胞懸浮在 2 m L PBS中,采用冰上超聲波破碎。破碎條件為強(qiáng)度 70,每超聲 15 s,于冰中靜置 15 s,如此反復(fù) 20次。將100μL的上清與終濃度為 0.25%的底物 L-Asn(溶于 100mmol/L PBS,pH 8.0)混合,在 37℃的水浴中孵育 15 min,用終濃度 5%的三氯醋酸溶液終止反應(yīng)。加入奈氏試劑,室溫反應(yīng) 15min后于450 nm波長下讀取吸收值。L-天冬酰胺酶Ⅱ的酶活性定義為能使底物每分鐘釋放切 1μmol氨的酶量為 1個(gè)單位。相關(guān)蛋白質(zhì)濃度的測定方法采用 BCA蛋白濃度測定試劑盒。

2 結(jié)果

2.1 重組載體 pFastBac1-polh的酶切鑒定

BamHⅠ和 EcoRⅠ雙酶切 pFastBac1-polh,切出一條 740 bp大小的片段(圖 1),其與 polh的PCR產(chǎn)物大小一致,表明重組載體 pFastBac1-polh構(gòu)建成功。

圖 1 pFastBac1-po lh的酶切鑒定

2.2 重組轉(zhuǎn)移載體 pFastBac1-polh-asp的酶切鑒定

用 EcoRⅠ和 HindⅢ雙酶切 pFastBac1-polhasp,得到約 1 000 bp插入片段,其大小與 asp加TEV酶酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的核苷酸序列一致(圖 2,泳道1和 2)。由 BamHⅠ單酶切 pFastBac1-polh-asp,切出一條 760 bp大小的片段,這與 polh加 TEV酶酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的核苷酸序列的大小一致(圖 2)。結(jié)果表明重組轉(zhuǎn)移載體 pFastBac1-polh-asp構(gòu)建成功。

圖 2 pFastBac1-polh-asp的酶切鑒定

2.3 Western blot分析

將重組桿狀病毒 r-polh-asp和親本病毒 Bm-pBacPAK6(對(duì)照)分別感染昆蟲細(xì)胞 BmN。培養(yǎng)72 h后,收集感染的細(xì)胞。通過 Western blotting對(duì)重組病毒的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果表明含重組病毒 r-polh-asp的表達(dá)產(chǎn)物在略大于 62 kD處出現(xiàn)一條特異條帶,與預(yù)期的結(jié)果(產(chǎn)物分子量 65 kD)相符,而 Bm-pBacPAK6感染的細(xì)胞并沒有對(duì)應(yīng)的蛋白帶的出現(xiàn),說明 polh和 asp基因在昆蟲細(xì)胞 BmN中成功融合表達(dá)。

圖 3 重組病毒r-polh-asp的表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting

2.4 L-天冬酰胺酶Ⅱ活性分析

活性使用奈氏試劑(the Nessler reagent)來檢測L-天冬酰胺酶Ⅱ的活性。標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品為己知濃度的硫酸銨。為排除桿狀病毒自身的影響,以 Bm-BacPAK6為對(duì)照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出在家蠶細(xì)胞 BmN中表達(dá)的重組大腸桿菌 L-天冬酰胺酶Ⅱ活性為 5 940U/mg。

3 討論

L-天冬酰胺酶Ⅱ是一種重要的蛋白類抗腫瘤藥物。與普通化療抗癌藥相比,L-天冬酰胺酶Ⅱ既可抑制癌細(xì)胞增殖,又不傷害正常細(xì)胞,有效地實(shí)現(xiàn)了酶的特異抗癌作用,因而倍受關(guān)注［6-7］。目前,L-天冬酰胺酶Ⅱ的生產(chǎn)大多采用以大腸桿菌為宿主的基因工程菌,進(jìn)行發(fā)酵。但是由于在生產(chǎn)上存在著發(fā)酵水平低和分離純化步驟繁多兩方面的問題,國內(nèi)臨床上所用注射 L-天冬酰胺酶主要是依靠進(jìn)口。因此,構(gòu)建能高效表達(dá)L-天冬酰胺酶并且其表達(dá)產(chǎn)物易于被純化的表達(dá)系統(tǒng)尤為重要。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)于大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)［8］:一是操作過程安全性高;二是病毒基因組內(nèi)的多角體基因(polh)等都是病毒復(fù)制的非必需基因,其啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子;三是可容納較大的外源片段的插入而不影響基因表達(dá)和病毒復(fù)制及包裝;四是表達(dá)水平較高。因此,在本實(shí)驗(yàn)中選擇桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。

為了更高效、更快速地純化表達(dá)產(chǎn)物,將多角體基因和 L-天冬酰胺酶Ⅱ融合表達(dá),其中間以 TEV酶酶切位點(diǎn)連接。多角體基因和 L-天冬酰胺酶Ⅱ融合表達(dá)有以下優(yōu)點(diǎn):一是便于確定細(xì)胞是否被感染,根據(jù)細(xì)胞是否出現(xiàn)多角體,判斷其感染情況。二是多角體是純化 L-天冬酰胺酶Ⅱ的接頭蛋白,通過偶聯(lián)多角體蛋白抗體的親和層析柱純化能得到純的多角體和 L-天冬酰胺酶Ⅱ融合蛋白。三是由于重組桿狀病毒 r-polh-asp能形成多角體,可以通過喂食多角體,使病毒 r-polh-asp感染家蠶并在其體內(nèi)表達(dá)L-天冬酰胺酶Ⅱ;喂食多角體比注射法損傷更小。

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S881.2

A

1007-0982(2011)02-0029-03

2011-02-18;

2011-03-05

費(fèi)建明(1962—),男,浙江湖州,碩士,高級(jí)農(nóng)藝師。

Tel:0572-2821600,E-mail:ajfjm@163.com