王紅梅 張國強 閔家新

第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院胸外科，重慶 400037

FADD在人肺腺癌細胞A549誘導(dǎo)T淋巴細胞凋亡中的作用

王紅梅 張國強 閔家新

第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院胸外科，重慶 400037

背景與目的：細胞凋亡是肺癌免疫逃逸的機制之一。Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas associated death domain protein，F(xiàn)ADD)在細胞凋亡過程中起著重要作用。本研究旨在探討FADD在人肺腺癌細胞A549誘導(dǎo)人T淋巴細胞凋亡過程中的作用。方法：用人肺腺癌細胞株A549細胞誘導(dǎo)人淋巴瘤T細胞株Jurkat細胞凋亡，分別于0、2、4和6 h后用流式細胞術(shù)檢測Jurkat細胞的凋亡率；RT-PCR及Western blot檢測Jurkat細胞中FADD的mRNA及蛋白表達情況。結(jié)果：人肺腺癌細胞A549誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡呈時間依賴性，各實驗組中Jurkat細胞表達FADD蛋白及mRNA水平較對照組顯著升高。結(jié)論：肺癌細胞可能通過影響T淋巴細胞FADD表達從而反擊機體免疫系統(tǒng)，達到自身免疫逃逸的目的。

肺癌； Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白； 凋亡

肺癌是常見惡性腫瘤之一，目前主要的治療方法為手術(shù)、化療及放療，但仍然存在術(shù)后復(fù)發(fā)率高，生存期短的問題［1］，因此肺癌的免疫治療已經(jīng)成為近年來研究的熱點。目前對肺癌發(fā)病機制的研究表明，在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中，肺癌細胞不僅可以通過“免疫逃逸”機制逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，減少自身凋亡；還可以通過“Fas反擊”機制造成宿主免疫能力降低［2］。由于Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas associated death domain protein，F(xiàn)ADD)是Fas凋亡信號途徑中的必需蛋白［3］，本研究利用人肺腺癌細胞株A549細胞誘導(dǎo)人淋巴瘤T細胞株Jurkat細胞凋亡，形成“Fas反擊”的體外細胞培養(yǎng)模型，檢測不同培養(yǎng)時間后Jurkat細胞凋亡及FADD表達的變化情況，為進一步明確FADD在肺癌免疫逃逸中的作用機制、尋找肺癌免疫治療新方法提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人肺癌細胞株A549由第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院呼吸研究所提供，人淋巴瘤T細胞株Jurkat(ATCC TIB-152)由上海麥莎生物科技有限公司代購；澳大利亞優(yōu)質(zhì)胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購于Hyclone公司。Annexin V(FITC)/PI凋亡檢測試劑盒購于杭州隆基生物工程研究所。蛋白提取液購于Pierce公司，羊抗人FADD單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體購于Santa Cruz公司，考馬斯亮藍試劑盒購于南京建成生物科技有限公司。總RNA提取試劑盒及兩步法RT-PCR試劑盒購于GENEAID公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

從液氮中取出凍存的A549細胞及Jurkat細胞，37 ℃迅速解凍，分別以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進行復(fù)蘇、培養(yǎng)，細胞傳至第4代左右，臺盼藍染色排斥法檢測2種細胞活性均在95%以上開始實驗。將A549細胞以5×105mL-1密度接種至培養(yǎng)瓶內(nèi)，待細胞長滿至85%左右，計數(shù)約1×106mL-1，吸去培養(yǎng)液；用含10%胎牛血清的RPMI 1640新鮮培養(yǎng)基將對數(shù)生長期約1×106個Jurkat細胞制成細胞懸液，加入A549細胞培養(yǎng)瓶中分別共培養(yǎng)0、2、4和6 h后分組收集Jurkat細胞。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測各組Jurkat細胞凋亡率

用離心管分別收集各組中Jurkat細胞，1 500 r/min、離心半徑5 cm，離心10 min，棄上清液，用PBS洗滌離心1次，棄上清液，向離心管中加入300 μL Banding buffer及5 μL AnnexinV-FITC，混勻，室溫避光溫育15 min，再加入5 μL PI，室溫避光溫育5 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率，同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為對照。

1.2.3 RT-PCR檢測各組Jurkat細胞中FADD的mRNA表達

將收集的Jurkat細胞用PBS離心洗滌后，按試劑盒說明書，提取細胞總RNA，采用兩步法進行R T-P C R操作。所用引物序列由華大基因上海鼎安生物科技有限公司設(shè)計，F(xiàn) A D D上游引物序列為：5’-CCGCCATCCTTCACCAGA-3’，下游引物序列為：5’-TACGAGATCCCGCTGCCT-3’，擴增片段長度為415 bp；GAPDH上游引物序列為：5’-CATGGGTGTGAACCATGAGAAGTA T-3’，下游引物序列為：5’-GACTGTGGTCAT GAGTCCTTCCA -3’，擴增片段長度為139 bp。取PCR產(chǎn)物5 μL，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳成像。

1.2.4 Western blot檢測各組Jurkat細胞中FADD蛋白表達

把已收集的Jurkat細胞用PBS洗滌，于1 500 r/min、離心半徑5 cm，離心10 min后，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白提取液，提取細胞總蛋白，用考馬斯亮藍G250試劑盒檢測蛋白濃度，畫蛋白標準曲線并調(diào)整濃度基本一致后100 ℃煮沸變性。取適量蛋白進行SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，封閉，按1∶1 000分別溫育羊抗人FADD單克隆抗體及鼠抗人β-actin單克隆抗體，4 ℃過夜后洗膜，按1∶1 000分別溫育二抗，洗膜后用化學發(fā)光底物顯影照相。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果用表示，利用SPSS 13.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Jurkat細胞凋亡率檢測

從檢測結(jié)果可以看出，在A549細胞對Jurkat細胞分別作用2、4和6 h后，Jurkat細胞凋亡率分別為(8.23±0.17)%、(9.11±0.21)%和(11.11±0.32)%，呈明顯增高趨勢；空白對照組凋亡率為(1.53±0.10)%，實驗組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；2 h組與6 h組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(圖1)。

2.2 FADD表達的檢測

各組中Jurkat細胞均表達FADD，所有實驗組中FADD蛋白及mRNA的表達均顯著高于對照組(P＜0.01)，隨A549作用時間的延長，各實驗組中Jurkat細胞在mRNA水平的FADD表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖2A、B)，各實驗組中FADD蛋白水平的表達也呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，實驗組顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，但組間差異并未達統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(圖3A、B)。

3 討 論

FADD又名MORT1、FAS相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白，存在于細胞胞質(zhì)中，是細胞凋亡信號通路中的胞質(zhì)死亡信號銜接蛋白，也是Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡途徑中的必需分子［4-6］。人FADD蛋白組織分布無特異性，存在于許多成年個體和胚胎的多種組織中。當Fas與FasL結(jié)合導(dǎo)致Fas胞內(nèi)的死亡域形成三聚體而活化，并引起與之結(jié)合的FADD構(gòu)象改變，使Caspase-8活化并激發(fā)下游的Caspase-3、6等級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細胞凋亡［7］。

研究表明，F(xiàn)ADD的表達在惡性腫瘤組織中低于腫瘤周邊正常組織。通過上調(diào)腫瘤組織中FADD的表達，可以促進腫瘤細胞凋亡的發(fā)生。但對于在腫瘤細胞免疫逃逸過程中，機體淋巴細胞表達FADD的變化情況研究很少。向青等［8］和王紅梅等［9］利用不同種類的人肺癌細胞株細胞誘導(dǎo)人淋巴瘤T細胞株Jurkat細胞凋亡，證實了肺癌細胞可以通過“Fas反擊”攻擊機體免疫系統(tǒng)，但對于這一過程中T淋巴細胞表達FADD的變化情況報道甚少。

本研究結(jié)果表明，在肺癌細胞A549介導(dǎo)的Jurkat細胞凋亡發(fā)生過程中，隨著凋亡的發(fā)生，Jurkat細胞中FADD蛋白及mRNA表達水平均明顯升高，由此可以推論，在肺癌發(fā)生、發(fā)展的進程中，肺癌細胞可能通過促進機體T淋巴細胞高表達FADD，導(dǎo)致部分T淋巴細胞的凋亡，從而逃避機體免疫系統(tǒng)的攻擊。同時研究發(fā)現(xiàn)，Jurkat細胞凋亡率隨著A549作用時間的延長而升高，呈時間依賴性；這也可以解釋肺癌患者晚期出現(xiàn)抵抗力下降、手術(shù)效果差等情況［10］。

Peggs等［11］的研究表明，化療藥物可以上調(diào)多種腫瘤細胞包括人淋巴瘤T細胞株Jurkat的FADD表達。結(jié)合本研究還可以推測，很多惡性腫瘤患者經(jīng)過化療后機體免疫狀況的下降，很可能與化療藥物引起機體T淋巴細胞FADD表達變化有關(guān)，F(xiàn)ADD可成為篩選化療藥物和化療方案的一個重要因子；同時，通過改變機體免疫系統(tǒng)FADD的表達來抑制腫瘤細胞的免疫逃逸也成為可能。

FADD不僅與細胞凋亡有關(guān)，還參與細胞周期的調(diào)控，與細胞增殖有關(guān)［12-13］。在此次試驗中，并未驗證人肺癌細胞A549作用導(dǎo)致Jurkat細胞中FADD改變的情況是否與細胞周期相關(guān)。在肺癌發(fā)病過程中，肺癌細胞是否通過改變宿主T淋巴細胞FADD的表達，影響T淋巴細胞的增殖，從而影響機體的免疫能力，還有待進一步研究。

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Role of FADD in apoptosis of T lymphocyte induced by human lung carcinoma cell A549

WANG Hong-mei,ZHANG Guo-qiang, MIN Jia-xin(Department of Thoracic Surgery, Xinqiao Hospital, the Third Military University, Chongqing 400037, China)

ZHANG Guo-qiang E-mail：Zhang006006@163.com

Background and purpose：Studies have conf i rmed that one mechanism of immune evasion in lung cancer is apoptosis, and the Fas associated death domain (FADD) is important in the process. This study aimed to investigate the function of Fas associated death domain (FADD) in apoptosis of T lymphocyte induced by human lung carcinoma cell A549.Methods：Human T lymphocytes (Jurkat cells) had been cocultured with human lung carcinoma cells (A549) for 0, 2, 4 and 6 h.Apoptosis rates of Jurkat cells was assessed by fl ow cytometry, the protein and mRNA expression of FADD in Jurkat cells were detected respectively by RT- PCR and Western blot.Results：There were time dependence significance in apoptosis rates and FADD expressions in Jurkat cells (P＜0.05).Conclusion：Changes of the FADD expression in T lymphocytes induced by human lung carcinoma cells play an important role in immune evasion of human lung carcinoma cells,it may facilitate the apoptosis of T lymphocytes and depress the immune competence.

Lung cancer; FADD; Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.06.007

R734.2

A

1007-3639(2011)06-0457-04

張國強 E-mail:Zhang006006@163.com

2011-03-04

2011-06-02）