溫秋婷 孫玉榮 李春紅 劉鴻宇 柏青楊

1齊齊哈爾醫(yī)學院病理學系，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2哈爾濱醫(yī)科大學病理學教研室，黑龍江 哈爾濱 150081

成纖維細胞激活蛋白對卵巢癌細胞增殖、遷徙和侵襲的影響

溫秋婷1孫玉榮1李春紅2劉鴻宇2柏青楊1

1齊齊哈爾醫(yī)學院病理學系，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2哈爾濱醫(yī)科大學病理學教研室，黑龍江 哈爾濱 150081

背景與目的：腫瘤間質(zhì)活化的成纖維細胞能表達成纖維細胞激活蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP)，本研究通過體外實驗研究FAP在卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷徙過程中的作用。方法：人類卵巢癌細胞系HO-8910PM體外培養(yǎng)，加入不同濃度的FAP(30、100和300 pmol/L)處理，用MTT法檢測FAP對HO-8910PM增殖的影響；細胞劃痕實驗檢測FAP對HO-8910PM遷徙能力的影響；Transwell侵襲實驗來研究FAP對HO-8910PM侵襲能力的影響。結果：MTT法及細胞生長曲線顯示FAP對卵巢癌細胞有促增殖作用，并呈時間、劑量依賴性；細胞劃痕試驗結果顯示，不同濃度的FAP對卵巢癌細胞系的遷徙均有促進作用，以100 pmol/L組最為明顯(P＜0.01)；Transwell侵襲實驗顯示FAP對卵巢癌細胞有促侵襲作用，以100 pmol/L組最為明顯(P＜0.01)。結論：FAP具有促進卵巢癌細胞的增殖、遷徙和侵襲的作用。

成纖維細胞激活蛋白； 腫瘤轉移； 卵巢癌細胞系HO-8910PM

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，卵巢癌浸潤、轉移是造成卵巢癌死亡率高的主要原因，因此對其浸潤和轉移機制研究已成為熱點。越來越多的研究證實，腫瘤的生物學特性不僅由癌基因和抑癌基因來調(diào)控，還依賴于間質(zhì)形成的微環(huán)境作用。腫瘤細胞通過誘導基質(zhì)(尤其是成纖維細胞)的活化，使成纖維細胞表達一些蛋白酶來參與侵襲和轉移過程［1］，腫瘤間質(zhì)中的成纖維細胞能表達多種蛋白酶，包括成纖維細胞激活蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP)，盡管一些惡性腫瘤細胞也能產(chǎn)生蛋白酶，但主要還是由宿主的間質(zhì)產(chǎn)生［2］。

FAP屬Ⅱ型膜結合型糖蛋白，是脯氨?；禺惖慕z氨酸寡肽酶家族(prolyl peptidase)成員之一，能專一性水解多肽中脯氨酸殘基的氨基端肽鍵，具有二肽基肽酶和膠原酶的活性［1］。FAP在正常人組織中一般無表達，僅選擇性表達于腫瘤微環(huán)境、愈合的創(chuàng)面及器官的生理性重建等［3-5］。因此，F(xiàn)AP在腫瘤相關成纖維細胞上的表達對形成促進腫瘤生長的微環(huán)境十分重要。

1 材料和方法

1.1 材料

高轉移性卵巢癌細胞系HO-8910PM購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，用含10%小牛血清(香港耐肯博國際生物有限公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Thermo公司)培養(yǎng)。FAPα純化蛋白購自中國臺灣Abnova公司，基質(zhì)膠購自美國BD Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌細胞系HO8910-PM的培養(yǎng)和傳代

凍存細胞復蘇后用完全培養(yǎng)基RPMI-1640將細胞接種密度調(diào)整為4×105～5×105mL-1，于37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換1次培養(yǎng)液。取生長狀態(tài)達到平臺期的細胞進行下面的實驗。

1.2.2 MTT比色法測增殖實驗

將HO8910PM接種(4.0×104mL-1)于96孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)12 h，含有5% FBS的培養(yǎng)基。換成含有0.1% FBS的培養(yǎng)基，細胞用不同劑量的FAP α (0、100或300 pmol/L)處理，處理后的72 h內(nèi)，每隔12 h各孔中分別加入20 μL新鮮配制的MTT溶液，37 ℃溫育3 h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，各孔加入150 μL DMSO，輕輕搖勻使結晶物充分溶解，在D490nm處讀取各孔的吸光值。

1.2.3 Wound Healing法測遷徙實驗

將HO8910PM接種(5.0×105mL-1)于12孔板中培養(yǎng)12 h細胞單層鋪滿。用無菌的200 μL槍頭在單層細胞上劃痕，劃痕面積大約10 mm×1 mm。各孔加入含有0.1% FBS的培養(yǎng)基，細胞分別用0、30、100和300 pmol/L的FAPα處理，由于腫瘤細胞具有遷徙能力，隨著時間的延續(xù)劃痕會逐漸愈合，用FAPα處理12、24、36和48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，并用Image Pro Plus軟件計算劃痕愈合的面積。

1.2.4 Transwell小室法測侵襲實驗

用Transwell小室法研究腫瘤細胞的侵襲能力。將50 μL Matrigel基質(zhì)膠均勻涂布于Transwell小室的上表面，常規(guī)胰酶消化收集HO-8910PM細胞，清洗離心(1 500 r/min，離心半徑5.8 cm，5min)后懸浮于含0.1%BSA的無血清培養(yǎng)基中，并計數(shù)1.1×106mL-1，每個Transwell小室內(nèi)均勻滴加170 μL，各小室分別加入FAPα 0、30、100和300 pmol/L，下室加含有10% FBS的PRMI-1640培養(yǎng)基。48 h后用棉簽擦去上室內(nèi)沒有侵襲過去的細胞，取下小室膜進行HE染色，在顯微鏡下隨機選取10個高倍視野計數(shù)每個膜侵襲過來的細胞數(shù)量。

2 結 果

2.1 FAPα對 HO-8910PM增殖的影響

為了驗證FAPα對HO-8910PM增殖能力的影響，用FAPα 100和300 pmol/L 2個濃度在不同的時間點進行增殖試驗。結果在體外加入不同濃度的FAPα，對卵巢癌細胞系HO-8910PM均有促增殖作用，并呈劑量依賴性(圖1)。FAPα促進HO-8910PM增殖的能力呈時間依賴性和劑量依賴性，在處理后48 h之內(nèi)作用最明顯(圖2)。

2.2 FAPα對 HO-8910PM遷徙的影響

劃痕實驗檢測FAPα對HO-8910PM遷徙能力。實驗結果表明，用FAPα處理后HO-8910PM細胞的遷徙能力明顯增強，在體外加入不同濃度FAPα的情況下，隨著時間的推移，并不是藥物濃度越大，癌細胞遷移速度越快，而是以100 pmol/L組引起的遷移效應最為明顯，30 pmol/L組和300 pmol/L組次之。FAPα處理后48 h FAPα100 pmol/L組的劃痕已經(jīng)基本愈合。

2.3 FAPα對 HO-8910PM侵襲的影響

為了檢測FAPα是否能增加HO-8910PM的侵襲能力，常規(guī)接種處于指數(shù)生長期，狀態(tài)良好的卵巢癌細胞HO-8910PM于Transwell上室，分別加入不同劑量的FAPα使其終濃度為0、30、100和300 pmol/L，進行Transwell侵襲實驗。結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)APα增強HO-8910PM的侵襲能力，以終濃度100 pmol/L作用最強(圖4、5)。

3 討 論

卵巢癌的浸潤和轉移是造成卵巢癌治療困難死亡率高的主要原因。越來越多的研究證實腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不是由上皮或間質(zhì)單方面作用所決定的，而是由兩者相互作用所形成的腫瘤-宿主界面微環(huán)境的平衡狀態(tài)來決定，活化的成纖維細胞即腫瘤相關成纖維細胞(tumor associated fibroblasts，TAF)是腫瘤間質(zhì)的主要成分，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著關鍵作用［6-9］。

大量的研究都傾向于癌細胞和間質(zhì)成纖維細胞通過彼此相互作用而影響細胞的生長、分化、侵襲和相互調(diào)控［10］。如結腸癌細胞可以通過釋放轉化生長因子β(TGF-β)誘導臨近間質(zhì)的成纖維細胞。成纖維細胞活化以后，通過分泌大量的細胞外基質(zhì)成分，如各種生長因子、膠原、蛋白酶和相應的抑制物反過來成倍地影響癌細胞本身［11］，這些變化誘導癌細胞發(fā)生侵襲前的生長行為［12-13］。腫瘤間質(zhì)的成纖維細胞表達多種蛋白酶，能分泌多種基質(zhì)酶如FAP，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)等，參與基質(zhì)的降解和癌周間質(zhì)的重建，因而與腫瘤細胞的浸潤和轉移有密切關系。

FAP是活化的成纖維細胞的標志性產(chǎn)物之一，是一種跨膜絲氨酸蛋白酶，具有二肽酶和膠原酶的雙重活性，可以水解基質(zhì)中二肽酶的許多底物、明膠以及Ⅰ型膠原，降解ECM，從而有利于腫瘤細胞從原發(fā)部位脫離、侵襲和遠距離轉移。通過降解ECM為內(nèi)皮細胞的增殖和移動創(chuàng)造條件，與肌成纖維細胞共同參與ECM重建，促進腫瘤微血管網(wǎng)的形成，對腫瘤的浸潤、轉移及逆轉具有重要意義［14］。本研究結果顯示，F(xiàn)APα能增加HO-8910PM的增殖、侵襲和遷移。

研究FAP在良惡性黑色素細胞瘤中表達發(fā)現(xiàn)，受檢的所有黑色素瘤和細胞痣活化基質(zhì)都可檢測到FAP(+)成纖維細胞，并且在原發(fā)性和轉移性黑色素瘤的活化基質(zhì)中可檢測到FAP的表達上調(diào)，這表明FAP對腫瘤細胞的生長和增殖可能具有調(diào)控作用［15］。另外臨床研究也表明，腫瘤間質(zhì)中FAPα高表達的結腸癌患者更容易出現(xiàn)病灶的轉移及復發(fā)［16］。在腫瘤的侵襲及轉移過程伴隨著FAPα的高表達，說明

FAP在腫瘤的侵襲及轉移過程中發(fā)揮重要的促進作用，其作用機制尚在研究中。目前科學界相對普遍接受的觀點是：FAPα和膜結合的信號傳導分子協(xié)同作用，利用FAPα的蛋白酶活性對信號分子或其他相關因子(例如肽類生長因子、趨化因子等)進行化學修飾，調(diào)節(jié)與腫瘤生長相關的興奮性信號的傳導。綜上所述，F(xiàn)AP在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移中發(fā)揮著重要作用；基于FAPα可作為一種抗腫瘤靶分子，靶位豐富，局部濃度高且無個體差異性，能夠針對絕大多數(shù)實體腫瘤發(fā)揮療效，國外許多研究機構正在努力探究以FAPα為靶標的腫瘤靶向治療的策略，并已取得一定成果，國內(nèi)相關研究也開始起步。

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Biological effect of fi broblast activation protein (FAP) in the proliferation, migration and invasion of ovarian cancer

WEN Qiu-ting, SUN Yu-rong, LI Chun-hong, LIU Hong-yu, BAI Qing-yang(Department of Pathology, Qiqihar Medical University, Qiqihar Heilongjiang 161006,China)

BAI Qing-yang E-mail：blbqy7@sohu.com

Background and purpose：Activated fi broblasts of tumor stroma can express fi broblast activation protein (FAP). The purpose of this research was to study the effect of FAP in the proliferation, migration and invasion of ovarian cancer cellsin vitro.Methods：Human ovarian cancer cell line HO-8910PM was culturedin vitroand was treated with different concentrations of FAP(30, 100 and 300 pmol/L), then examined the function of FAP in the proliferation, migration and invasion of HO-8910PM by the colorimetric MTT Assay, Wound-Healing Assay and Transwell Assay.Results：Colorimetric MTT Assay and the curve of reproduction of cells showed that FAPα could increase HO-8910PM cell proliferation in a duration- and dose-dependent manner; Wound-Healing Assay conf i rmed that FAPα could promote the migration of the ovarian cancer cells, especially the function of 100 pmol/L group (P＜0.01);Transwell Assay certified that FAPα could promote the invasion of the ovarian cancer cells, especially the function of 100 pmol/L group (P＜0.01).Conclusion：FAP may induce the ovarian cancer cells proliferation, invasion and migration.

Fibroblast activation protein; Tumor metastasis; Ovarian cancer cell line HO-8910PM

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.06.004

R737.31

A

1007-3639(2011)06-0441-05

柏青楊 E-mail:blbqy7@sohu.com

2011-03-15

2011-05-30）