丁 晧,裘俊紅

(浙江工業(yè)大學(xué) 綠色化學(xué)合成技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,浙江 杭州 310032)

螺旋藻是一種絲狀多細(xì)胞螺旋形原核藻類生物,具有蛋白含量高、繁殖速度快等特點(diǎn)[1-2].藻藍(lán)蛋白是螺旋藻細(xì)胞中重要的光合作用天然色素,廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、染料等工業(yè).鑒于藻藍(lán)蛋白具有良好的開發(fā)前景,其理論研究和應(yīng)用已成為螺旋藻類蛋白研究的熱點(diǎn)[3-7].藻藍(lán)蛋白是胞內(nèi)蛋白質(zhì),因此要破碎胞壁、胞膜使藻藍(lán)蛋白以溶解的狀態(tài)溶于提取液中,再將其沉淀,在提取過程應(yīng)保持蛋白的活性.細(xì)胞破碎的方法主要有:反復(fù)凍融法、化學(xué)試劑處理法、溶脹法、超聲波法和組織搗碎法等方法.蛋白質(zhì)沉淀方法有:鹽析法、結(jié)晶法、等電點(diǎn)沉淀法和超濾法等方法[8].

反膠束萃取技術(shù)是一項(xiàng)新型、有發(fā)展?jié)摿Φ纳镂镔|(zhì)分離技術(shù).反膠束萃取技術(shù)的應(yīng)用過程中,不存在毒性試劑,對人體無害,成本低,且反膠束溶液可反復(fù)利用,還可以連續(xù)操作,處理量大,成本較低及近年來與其它應(yīng)用技術(shù)如超臨界的結(jié)合等方面,在工業(yè)化生產(chǎn)方面都顯示了較大的應(yīng)用潛力.反膠束體系內(nèi)的“微水池”是一種類生命環(huán)境介質(zhì),其內(nèi)的蛋白質(zhì)不易變性,可廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)活性控制及提取.反膠束法在萃取單一或混合氨基酸的分離中也已表現(xiàn)出很大優(yōu)越性,萃取機(jī)理也有了論斷,但尚存在許多問題亟待解決,如萃取機(jī)理的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等[9].反膠束水合萃取分離技術(shù)是將水合物的生成與反膠束萃取耦合在一起,生成水合物的同時(shí)可以消耗反膠束中的水分,幫助包含在反膠束中的蛋白質(zhì)析出.Phillips等[10]曾利用水合物的生成從生化溶液中回收蛋白酶,而其它的相關(guān)研究甚少.反膠束水合萃取藻藍(lán)蛋白在保證藻藍(lán)蛋白活性的同時(shí)完成萃取和反萃取過程,操作較為簡單.筆者通過構(gòu)建CTAB/正辛烷-正戊醇反膠束體系,研究此體系中水合物生成對其內(nèi)的藻藍(lán)蛋白的萃取作用,考察溫度、壓力、CTAB濃度和初始含水量W0(初始條件下有機(jī)溶劑中水的摩爾濃度與表面活性劑的摩爾濃度之比)對反膠束水合萃取藻藍(lán)蛋白的影響.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器:水合物裝置,低溫冰箱,高速離心機(jī),微量注射器等.

試劑:CTAB(十六烷基三甲基溴化銨),正辛烷,正戊醇,蛋白濃度測定試劑(Folin-酚試劑),牛血清蛋白等.

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 螺旋藻細(xì)胞破壁

稱取一定量的螺旋藻粉,加入0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH=7.0),采用反復(fù)凍融(3次)的方法[11]對藻體細(xì)胞進(jìn)行破碎.將破碎的螺旋藻細(xì)胞懸濁液于4 000 r/min離心20 min,傾倒上清液,可得到含藻藍(lán)蛋白的粗提液.

1.2.2 反膠束制備

將CTAB溶解于按一定比例配制的正辛烷和正戊醇混合液中,在磁力攪拌下用微量注射器逐步加入一定量的水.經(jīng)過充分?jǐn)嚢韬?靜置,觀察溶液的透明度,若透明則表明溶液中形成反膠束體系.

1.2.3 反膠束水合萃取藻藍(lán)蛋白

將螺旋藻粗提液用微量注射器加入形成反膠束體系的溶液中,然后將溶液置于高壓釜內(nèi).在不同溫度、壓力、反膠束濃度以及初始含水量條件下進(jìn)行反膠束水合萃取實(shí)驗(yàn).圖1為水合萃取裝置簡圖.該裝置依據(jù)加拿大 Bishnoi教授[12]實(shí)驗(yàn)室的湍動界面(氣-水)型水合物裝置設(shè)計(jì)而成.

圖1 反膠束水合萃取實(shí)驗(yàn)裝置Fig.1 Experimental apparatus for reverse micellar hydrated extraction

1.2.4 藻藍(lán)蛋白濃度及萃取率計(jì)算

Folin-酚法測定藻藍(lán)蛋白濃度:不同濃度牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)Folin-酚試劑處理,檢測640 nm處的吸收值,繪制OD640-蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,適度稀釋的待測樣品經(jīng)Folin-酚試劑同法處理后,測定640 nm處的吸收值,并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對應(yīng)的蛋白濃度,計(jì)算待測藻藍(lán)蛋白的濃度.

反膠束水合萃取藻藍(lán)蛋白的萃取效果可以用藻藍(lán)蛋白的萃取率E表示為

式中:[PC]t,[PC]0分別為萃取后溶液中藻藍(lán)蛋白的質(zhì)量濃度和粗提液中藻藍(lán)蛋白的質(zhì)量濃度,mg/mL;Vt,V0分別為萃取后溶液體積和粗提液體積,mL.

2 結(jié)果與討論

2.1 藻藍(lán)蛋白反膠束水合萃取效果分析

螺旋藻粗提液和反膠束水合萃取液用紫外光譜儀在λ取0～800 nm范圍內(nèi)分別測其吸收光譜峰的吸光度,在紫外區(qū)200～400 nm均有強(qiáng)吸收峰.粗提液在λ=618 nm處都有最大吸收,在λ=650 nm左右處有一肩峰,如圖2所示.620 nm和650 nm處的吸收峰分別是藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白的特征吸收峰[13].由于粗提液未經(jīng)進(jìn)一步提取純化,650 nm處的肩峰表示別藻藍(lán)蛋白的含量較高,如圖3所示,經(jīng)反膠束水合萃取后溶液中藻藍(lán)蛋白純度有所提高,λ=650 nm左右的峰已不明顯,表示別藻藍(lán)蛋白含量有所降低,藻藍(lán)蛋白的純度提高.但是反膠束水合實(shí)驗(yàn)方法不成熟,過程中有部分藻藍(lán)蛋白損失,所以圖3中吸光度相比粗提液有所下降.

2.2 藻藍(lán)蛋白反膠束水合萃取過程分析

為分析反膠束體系中藻藍(lán)蛋白的水合萃取行為,選取一個(gè)如圖4所示的存在相界面的小型反膠束體系.

圖4 藻藍(lán)蛋白水合萃取行為Fig.4 Kinetic behavior of reverse micellar hydrated extraction of phycocyanin

反膠束水合萃取藻藍(lán)蛋白的過程描述:螺旋藻粗提液中的藻藍(lán)蛋白被包裹在反膠束體系內(nèi)的“水池”中;伴隨水合物的生成,“水池”中的部分水分用于生成水合物,“水池”中水分減少導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白從反膠束體系中析出.在有表面活性劑覆蓋的相界面上,藻藍(lán)蛋白的萃取過程可以認(rèn)為由兩個(gè)步驟組成:一是聚結(jié),“滿膠束”觸及界面并聚結(jié),但并不是每次與相界面碰撞都發(fā)生聚結(jié);二是分離,反膠束的囊狀表面活性劑層沒入平的界面層,藻藍(lán)蛋白同時(shí)從帶電界面離開.有文獻(xiàn)[14]認(rèn)為聚結(jié)步驟為界面?zhèn)髻|(zhì)過程中最慢的一步,處于“水池”內(nèi)的藻藍(lán)蛋白與反膠束的表面活性劑層之間的靜電作用,改變了膠束表面的性能,并影響到“滿膠束”的表面活性劑層與主體界面間的作用.當(dāng)整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系達(dá)到平衡后,藻藍(lán)蛋白將存在于4種位置:(1)存在于反膠束的“水池”內(nèi);(2)存在于反膠束外的連續(xù)有機(jī)相中;(3)存在于過剩水中;(4)獨(dú)立或被水合物包裹沉淀于釜底.由于藻藍(lán)蛋白在有機(jī)相中的溶解度極小,水合物的形成結(jié)合了絕大部分水分,因此實(shí)驗(yàn)中認(rèn)為沉淀到釜底的藻藍(lán)蛋白即為提取到的藻藍(lán)蛋白.

2.3 影響藻藍(lán)蛋白萃取率的因素分析

表1分析了溫度、壓力、CTAB以及初始含水量W0對藻藍(lán)蛋白萃取率的9組正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與極差分析.表中Kij求得的第 j列上第i個(gè)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總和平均值;D為對藻藍(lán)蛋白萃取率的極差.

表1 藻藍(lán)蛋白萃取率的極差分析數(shù)據(jù)Table 1 Range analysis date of phycocyanin extraction rate

由表1可見,溫度、壓力、CTAB濃度及初始含水量W0對反膠束水合萃取藻藍(lán)蛋白萃取率的影響程度從大到小的順序?yàn)镃TAB濃度＞初始含水量＞壓力＞溫度.

一定的壓力是水合物生成必需滿足的條件.壓力越高,水合物生成的推動力越大,水合物就越容易生成,生長和成核速率也就越快.乙烯作為水合物形成氣,隨著壓力的升高,溶解于反膠束體系的量也不斷增加,即體系中乙烯過飽和度增加,促進(jìn)了水合物進(jìn)一步生成.壓力是影響水合物生成的一個(gè)重要的因素,但是由于反膠束水合萃取藻藍(lán)蛋白的實(shí)驗(yàn)中體系的水量非常少,所以氣量對水量的比例很大,較低的壓力也能很好的生成水合物,因此,在一定范圍內(nèi)的壓力高低對藻藍(lán)蛋白率的影響不大.

一定壓力下水合物的平衡溫度和實(shí)驗(yàn)溫度之差稱為過冷度.這說明溫度對反膠束體系水合物生成的影響,實(shí)質(zhì)上也就是過冷度的影響.隨實(shí)驗(yàn)初始溫度降低,過冷度增加,有利于水合物生成.但由于體系水量的稀少,溫度在對水合物生成行為和實(shí)驗(yàn)前后反膠束含水量W0變化的影響中都屬于非顯著性因素.

水合萃取的本質(zhì)是在調(diào)節(jié)反膠束體系含水量W0,從而使藻藍(lán)蛋白從反膠束體系中析出.初始具有大量的水有利于水合物生成前反膠束體系能溶解更多的藻藍(lán)蛋白,從而能有效提高藻藍(lán)蛋白的萃取率.

為保持反膠束的穩(wěn)定性,便于研究反膠束體系性質(zhì),反膠束中增溶的水分采用注入法,且增溶水量控制在反膠束最大含水量之內(nèi),所以實(shí)驗(yàn)反膠束體系中水量很少.由于CTAB濃度的適當(dāng)增加也將會使得水合物生成速率大幅提高[15],有利于藻藍(lán)蛋白從反膠束中析出.但是表面活性劑濃度過高將導(dǎo)致反膠束體系黏度增大,難以分相,同時(shí)水的乳化程度也加大,因此CTAB濃度不宜過高.

3 結(jié) 論

研究表明,在初始溫度 3℃,初始壓力4 MPa,CTAB濃度0.10 mol/L,初始含水量40的條件下,水合萃取藻藍(lán)蛋白的萃取率可達(dá)81.3%,表明該條件時(shí)的萃取效果比較好.由于水合萃取實(shí)驗(yàn)中氣液比較大,所以在一定范圍內(nèi)初始溫度和壓力對萃取效果影響不大,屬于非顯著性因素,而較大的反膠束濃度和初始含水量有利于提高藻藍(lán)蛋白萃取率.研究發(fā)現(xiàn)水合萃取過程通過去除一定量的別藻藍(lán)蛋白得以純化藻藍(lán)蛋白,提高了藻藍(lán)蛋白純度.反膠束水合萃取完成了萃取、反萃取以及純化過程的有效耦合,相對于加鹽反萃取操作難度有所下降;但此方法仍很不成熟,研究中也發(fā)現(xiàn)有部分藻藍(lán)蛋白流失.

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