張翠萍,李行諾,陳鴛誼,葛志偉,顏繼忠

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江杭州 310032;2.浙江大學(xué) 藥物信息學(xué)研究所,浙江杭州 310058)

反相高效制備液相色譜法制備洋川芎內(nèi)酯H和I

張翠萍1,李行諾1,陳鴛誼1,葛志偉2,顏繼忠1

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江杭州 310032;2.浙江大學(xué) 藥物信息學(xué)研究所,浙江杭州 310058)

從川芎中分離制備洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯I對照品.用8倍量80%乙醇回流提取川芎藥材,得到川芎浸膏經(jīng)D-101大孔吸附樹脂、硅膠柱色譜及反相高效制備液相色譜分離,獲得兩個化合物單體.經(jīng)核磁共振波譜分析,確定其分別為洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯I,兩者純度均高于98%,可作為對照品進(jìn)行定量分析.該方法操作簡單,重現(xiàn)性好,上樣量大,能夠同時獲得大量的高純度的目標(biāo)成分,為洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯I單體的制備研究提供了一種新的方法.

反相高效制備液相色譜法;川芎;洋川芎內(nèi)酯H;洋川芎內(nèi)酯I

洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯I是一對結(jié)構(gòu)相似的苯酞類化合物(圖1),在中藥川芎(Ligusticum chuanxiongHort)中含量較大[1].現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),二者對于心血管和腫瘤疾病具有較好的療效[2-7].但二者化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,在高溫和堿性條件下易發(fā)生分解、縮合等反應(yīng)[8-9].采用傳統(tǒng)的分離純化方法,操作繁雜,分離效率低,難以獲得二者高純度的單體.

高效制備液相色譜法不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制,分離效能高、分析速度快、檢測靈敏,操作簡單,上樣量大,重現(xiàn)性好,適合分離純化不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物.本實(shí)驗使用反相高效制備液相色譜并結(jié)合D-101大孔吸附樹脂、開放硅膠柱色譜,從中藥川芎中同時分離制備洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯I,為建立川芎藥材及其制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ).

圖1 洋川芎內(nèi)酯H(Ⅰ)和洋川芎內(nèi)酯I(Ⅱ)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures o f senkyuno lide H(Ⅰ)and senkyunolide I(Ⅱ)

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-8A高效制備液相色譜儀(日本島津制作所),包括SPD-M 20A diode array Detector,LC-8ADvp兩元泵,LCsolution色譜數(shù)據(jù)工作站;Lum tech(綠綿)分析型高效液相色譜儀;M ini spin離心機(jī)(Eppendorf公司);U ltrasonic Generator(型號H 66MC,無錫超聲電子設(shè)備有限公司);梅特勒托利多A L104電子天平(瑞士 Mettler To ledo);Bruker AC-80核磁共振儀(NMR);島津 UV 2487紫外光譜儀;Eyela旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;M illi-Q純凈水;100-200目硅膠(青島海洋化工廠);硅膠GF254由青島海洋化工廠生產(chǎn);D-101型大孔吸附樹脂(安徽三星樹脂科技有限公司);色譜甲醇(江蘇漢邦科技有限公司);石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯和乙醇均為分析純;川芎藥材購于杭州胡慶余堂,樣品保存于浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院.

1.2 樣品前處理

取川芎藥材3 kg,粉碎成粗粉,8倍量80%乙醇回流提取2次,合并提取液,減壓濃縮成浸膏750 mL,加適量純凈水混合分散至1450 mL,加到處理好的D101大孔吸附樹脂(1300 g,φ10 cm ×100 cm)中,靜止吸附6 h,用水洗至還原糖呈中性(M olish反應(yīng)),分別用50%和90%的乙醇溶液洗脫大孔吸附樹脂,并收集洗脫液,減壓濃縮.得到50%乙醇洗脫組分26 g,90%乙醇洗脫組分65.6 g.洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯I結(jié)構(gòu)中含有兩個羥基,極性較大,因此,主要集中在50%乙醇洗脫組分中.將50%乙醇洗脫組分干膏26 g用乙醇溶解拌入硅膠(100～200目)55 g,減壓旋干,干法上樣,使用正相硅膠柱色譜進(jìn)行分離(100～200目,φ5 cm ×80 cm),干膏與硅膠質(zhì)量比為1∶30,以石油醚-乙酸乙酯為流動相進(jìn)行梯度洗脫(95∶5～0∶100),得到6個組分Fr.1(1.759 8 g),Fr.2(3.312 4 g),Fr.3(9.832 1 g),Fr.4(2.985 1 g),Fr.5(1.479 8 g),Fr.6(2.304 2 g).

1.3 色譜條件

1.3.1 制備型HPLC

Agilent ZORBAX SB-C18柱(250mm×21.2 mm,7μm),流動相為甲醇-水,檢測波長為280 nm;流速為8mL/min;進(jìn)樣體積3mL,柱溫為室溫.色譜條件如表1所示.

表1 制備液相色譜條件Table 1 The operation conditions of Pre-HPLC

1.3.2 分析型HPLC

Agilent Lichrosper RP-C18,(5μm,250 mm×4.6mm);流動相為甲醇-水;檢測波長為280 nm;流速0.5mL/m in;進(jìn)樣體積 10μL;化合物Ⅰ和化合物Ⅱ進(jìn)樣濃度分別為7.9 mg/mL和5.0 m g/mL;柱溫為30℃;化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的色譜條件如表2,3所示.

表2 化合物Ⅰ分析液相色譜條件Table2 HPLC operation conditions of compoundⅠ

表3 化合物Ⅱ分析液相色譜條件Table3 HPLC operation conditions of compoundⅡ

1.4 純品的制備

取Fr.4樣品2.985 1 g,用 18 mL甲醇溶解,經(jīng)離心后取上清液進(jìn)樣,進(jìn)行高效液相制備色譜分離,按上述制備色譜條件洗脫,收集31～32 m in和34～36 m in兩段組分(圖 2),減壓濃縮,冷凍干燥,得到化合物Ⅰ(0.085 7 g)和化合物Ⅱ(0.962 4 g).

圖2 高效制備液相色譜分離Fr.4組分色譜圖Fig.2 Preparative chromatogram of Fr.4

2 結(jié) 果

2.1 純度檢測

使用高效液相色譜法對分離得到的化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的純度進(jìn)行檢測,經(jīng)面積歸一化法計算,化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的純度均大于98%(圖3,4).

圖3 化合物Ⅰ的液相分析圖Fig.3 Chromatogram of compoundⅠ

圖4 化合物Ⅱ的液相分析圖Fig.4 Chromatogram of compoundⅡ

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 化合物Ⅰ的結(jié)構(gòu)鑒定

黃色油狀物.1H-NMR(CDCl3,500 MH z,δ)∶0.94(3H,t,J=7.5 Hz,H-11),1.49(2H,tq,J=7.5,7.5 H z,H-10),1.82～1.88,2.03～2.10(2 H,m,H-5),2.36(2H,dt,J=7.5,7.5 Hz,H-9),2.32～2.43,2.61～2.67(2H,m,H-4),3.97(1H,tq,J=6.5,3.5 H z,H-6),4.59(1H,d,J=3.5 H z,H-7),5.30(1H,t,J=8.0 H z,H-8);13C-NMR(CDCl3,125 MHz,δ)∶169.2(C-1),153.8(C-3),148.1(C-3a),125.8(C-7a),114.2(C-8),68.2(C-6),62.3(C-7),27.9(C-9),26.8(C-5),22.1(C-10),19.2(C-4),13.6(C-11).將其核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對照鑒定化合物Ⅰ為洋川芎內(nèi)酯H.

2.2.2 化合物Ⅱ的結(jié)構(gòu)鑒定

淡黃色油狀物.1H-NMR(CDCl3,500 MHz,δ)∶0.95(3H,t,J=7.5 Hz,H-11),1.49(2H,tq,J=7.5,7.5 Hz,H-10),1.86～1.92,2.04～2.07(2H,m,H-5),2.33(2H,dt,J=8.0,7.5 Hz,H-9),2.44～2.56(2H,m,H-4),3.94(1H,ddd,J=8.5,5.5,3.0 Hz,H-6);4.45(1H,d,J=5.5 Hz,H-7),5.29(1H,t,J=8.0Hz,H-8);13C-NMR(CDCl3,125MHz,δ)∶169.2(C-1),153.1(C-3),148.1(C-3a),125.8(C-7a),114.4(C-8),71.7(C-6),67.6(C-7),28.1(C-9),26.5(C-5),22.3(C-10),19.0(C-4),13.8(C-11).將其核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對照鑒定化合物Ⅱ為洋川芎內(nèi)酯I.

3 結(jié) 論

本實(shí)驗使用D-101型大孔吸附樹脂除去川芎提取物中的水溶性雜質(zhì)后,分別用50%和90%的乙醇洗脫,將川芎提取物粗分成兩段,得到大極性段和小極性段,由于洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯I結(jié)構(gòu)中含有兩個羥基,極性較大,所以二者主要集中在50%洗脫組分中.然后使用快速正相硅膠柱色譜富集的方法得到洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯I含量較高的組分Fr.4.川芎化學(xué)成分復(fù)雜,本實(shí)驗采用大孔吸附樹脂進(jìn)行粗分,有利于后續(xù)的分離與純化.由于洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯I兩個化合物的結(jié)構(gòu)非常相似,其液相色譜峰距離很近.使用等度洗脫法對該二者化合物進(jìn)行分離時,發(fā)現(xiàn)分離時間過長、制備效率較低、溶劑消耗較大.因此,本實(shí)驗使用梯度洗脫法來制備分離洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯I.

本實(shí)驗采用多波長掃描的方式對洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯I進(jìn)行制備液相色譜分離,在實(shí)驗過程中可同時獲得320,280,254,210 nm波長下的液相圖譜.在這4個波長下Fr.12中所含有的各種化學(xué)成分基本都能出峰,并同時呈現(xiàn)于一張圖譜中,這樣更便于觀察各峰之間的分離度,有利于目標(biāo)成分的收集,從而獲得高純度的化合物單體.

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Isolation and purification of senkyunolide H and Iby preparative reversed-phase high performance liquid chrom atography

ZHANG Cui-ping1,LIXing-nuo1,CHEN Yuan-yi1,GE Zhi-wei2,YAN Ji-zhong1
(1.College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,H angzhou 310032,China;2.Pharmaceu tical Informatics Institute,Zhejiang University,H angzhou 310058,China)

Senkyunolide H and Iwere separated and purified fromLigusticum chuanxiongby using 8 times the amountof80%ethanol to extractLigusticum chuanxiongHort.The ethanolextractwas subjected to D101 macroporous adsorption resin,silica gel,and preparative reversed-phase HPLC for the isolation of target compounds.Their structures were elucidated as senkyunolide H and I by NMR spectral analysis.And thepurity of each compound was above 98%.Thismethod is simple,effective,and reliable for the preparation of senkyunolide H and Isimu ltaneously with good reproducibility and high purity.

preparative reversed-phase high performance liquid chromatography;Ligusticum chuan xiongHort;senkyuno lide H;senkyunolide I

R284.1

A

1006-4303(2011)04-0386-04

2010-03-18

國家重大科技專項“重大新藥創(chuàng)制”資助項目(2009ZX09313-036)

張翠萍(1982—),女,河北廊坊人,碩士研究生,研究方向為生物化工,E-mail：zhangcuip314@sohu.com.通信作者：顏繼忠教授,E-mail：yjz@zjut.edu.cn.

(

陳石平)