孫忠學(xué) 董春梅
(黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司,黑龍江 哈爾濱 150078)
Agilent 1100液相色譜儀(四元泵,二極管陣列檢測器);電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特有限公司);R2003KE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝科技有限公司);電子天平 (Mettler instrument Corp);101-2型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海市試驗(yàn)儀器廠);GT-350W型超聲波提取器(濟(jì)寧科特超聲電子有限公司);硅膠G薄層板(中國海洋化工廠生產(chǎn))
1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
1.1.2 藥品與試劑
柴胡皂苷a對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所,批號(hào)110777-200406);黃芩苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所 715-200111);黃芩素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所111595-200604);漢黃芩素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所 1514-200202);中性氧化鋁、三氯甲烷、正丁醇、氨試液、甲醇、乙醚、硫酸、乙醇均為分析純、水為蒸餾水。
1.2.1 黃芩苷的含量測定
1.2.1.1 色譜條件
色譜柱:YMC-Pack ODS-A(150×4.6mm ID);流動(dòng)相:甲醇-水-磷酸(47:53:0.2);檢測波長:280nm
1.2.1.2 供試品溶液制備
稱取凍干粉末0.05g,加50%的甲醇于10ml容量瓶中,超聲30min,補(bǔ)充50%的甲醇于刻度,用0.45μl的濾膜過濾,作為供試品溶液。
1.2.1.3 對(duì)照品溶液制備
精密稱取黃芩苷對(duì)照品0.3mg加50ml甲醇溶解制成每1ml含0.06mg的溶液,即得。
1.2.1.4 空白試驗(yàn)
按處方比例及制劑工藝制備缺黃芩陰性對(duì)照藥,按“1.4.1.2供試品溶液制備”項(xiàng)下方法制備缺黃芩陰性對(duì)照品溶液。
精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和缺黃芩陰性對(duì)照品溶液各10μl,進(jìn)樣測定,結(jié)果供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相同的保留時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的色譜峰,而陰性對(duì)照品溶液則在相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間未見相對(duì)應(yīng)的吸收峰。有關(guān)對(duì)照品、供試品和缺黃芩陰性對(duì)照品的色譜圖和光譜圖見附圖1-5(a~c)。
1.2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
取本品,按上述制備方法制備供試品溶液,分別放置 0、2、4、6、8 小時(shí),精密吸取10μl,注入液相色譜儀,測定其含量,結(jié)果黃芩苷的平均峰面積為 2488.56,RSD為0.22%。結(jié)果表明,供試品溶液在8小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定,可滿足測定要求。
1.2.1.6 精密度實(shí)驗(yàn)
精密吸取同一對(duì)照品溶液10μl,重復(fù)進(jìn)樣5次,測定黃芩苷的峰面積,結(jié)果黃芩苷的平均峰面積為1888.2,RSD為0.58%,說明儀器精密度較好。
1.2.2 芍藥苷的含量測定
1.2.2.1 色譜條件
色譜柱:YMC-Pack ODS-A(150×4.6mm ID);流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸溶液(14:86);檢測波長為230nm
1.2.2.2 供試品溶液制備
稱取凍干粉末0.1g,加5稀乙醇于10ml容量瓶中,超聲30min,補(bǔ)充稀乙醇于刻度,用0.45μl的濾膜濾過,作為供試品溶液。
1.2.2.3 對(duì)照品溶液制備
精密稱取芍藥苷對(duì)照品0.7mg加10ml甲醇溶解制成每1ml含0.07mg的溶液即得。
1.2.2.4 空白實(shí)驗(yàn)
陰性對(duì)照品溶液的制備:按處方比例及制劑工藝制備缺白芍的陰性對(duì)照藥,按“1.2.2.2供試品溶液制備”項(xiàng)下方法制備缺白芍陰性對(duì)照品溶液。
精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和缺白芍陰性對(duì)照品溶液各10μl,進(jìn)樣測定,結(jié)果供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相同的保留時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的色譜峰,而陰性對(duì)照品溶液則在相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間未見相對(duì)應(yīng)的吸收峰。有關(guān)對(duì)照品、供試品和缺白芍陰性對(duì)照品的色譜圖和光譜圖見附圖1-11(a~c)。
1.2.2.5 線性關(guān)系考察
精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液(濃度為0.50mg/ml)0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,分別置于10ml容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,再分別精密吸取10μl,分別注入液相色譜儀,按上述條件測定白芍的吸收峰峰面積,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行回歸處理,結(jié)果黃芩苷在0.02~0.10mg范圍內(nèi),進(jìn)樣量與峰面積積分值之間線性關(guān)系良好,回歸方程為 Y=12.269X-14.107,r=0.9999(n=6)。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1進(jìn)樣量-峰面積積分值見表 1。
表1 芍藥苷線性關(guān)系考察結(jié)果表
圖1 芍藥苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線
1.2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
取本品,按上述制備方法制備供試品溶液,分別放置 0、2、4、6、8 小時(shí),精密吸取10μl,注入液相色譜儀,測定其含量,結(jié)果芍藥苷的平均峰面積為698.52,RSD為0.22%。結(jié)果表明,供試品溶液在8小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定,可滿足測定要求。穩(wěn)定性結(jié)果見表2
表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.2.2.7 精密度實(shí)驗(yàn)
精密吸取同一對(duì)照品溶液10μl,重復(fù)進(jìn)樣5次,測定芍藥苷的峰面積,結(jié)果平均峰面積為922.18,RSD為0.70%,說明精密度較好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表3。
表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.2.2.8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)
取同一批樣品,制備 6份供試品溶液,按擬定的含量測定方法,重復(fù)平行測定,黃芩苷的平均含量為0.8256mg/g,RSD為0.18%。重復(fù)性結(jié)果見表3。
表3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.2.2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)
取已知含量配制好的樣品溶液(58.5μg/ml)28ml,精密稱定,置 50ml容量瓶中,加入精密稱定好的黃芩苷對(duì)照品1.55mg,補(bǔ)足甲醇至刻度,稱定重量,以下按供試品溶液制備方法操作,制成加樣供試品溶液。吸取加樣供試品溶液 10μl,注入液相色譜儀,按上述方法測定加樣供試品溶液中黃芩苷的含量,分別計(jì)算回收率。
表4 柴胡桂枝固體湯劑中的黃芩苷的含量
1.2.2.10 芍藥苷的含量測定
按本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)“含量測定”項(xiàng)下方法操作,制備供試品溶液,測定三批樣品中黃芩苷的含量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表4。結(jié)果表明芍藥苷的含量基本穩(wěn)定。
本章對(duì)進(jìn)行了柴胡桂枝固體湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。采用薄層色譜對(duì)人參、柴胡、甘草及黃芩進(jìn)行了鑒別,并對(duì)凍干粉的水分測定、裝量差異、微生物限度的檢查,同時(shí)采用高效液相法測定了制劑中的黃芩苷及芍藥苷的含量。方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,該測定方法準(zhǔn)確可靠,方便易行,可以作為柴胡桂枝固體湯劑的質(zhì)量控制方法。