程 悅， 陳嘉升， 陳建萍， 王冬梅*

(1.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510006;2.香港大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，香港)

地榆為薔薇科植物地榆Sanguisorba officinalisL.或長(zhǎng)葉地榆Sanguisorba officinalisL.var.longifolia(Bert.)Yü et Li的干燥根，主產(chǎn)于東北、內(nèi)蒙古、山西、陜西、河南、廣西等地。地榆味苦、酸、澀，微寒，歸肝、大腸經(jīng)，用于治療便血，痔血，血痢，崩漏，水火燙傷，癰腫瘡毒等癥［1］。鞣質(zhì)類和三萜類化合物是地榆的主要化學(xué)成分，鞣質(zhì)是其發(fā)揮收斂止血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)［2］。

鞣質(zhì)(Tannins)又稱單寧，是存在于植物體內(nèi)的一類結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的多酚類化合物。K Frendenberg于1920年按照鞣質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征將其分為可水解鞣質(zhì)(hydrolysable tannin)和縮合鞣質(zhì)(condensed tannin)兩大類［3］?？伤怊焚|(zhì)，即沒(méi)食子酸酯類多酚，是多元醇與沒(méi)食子酸或與沒(méi)食子酸有生源關(guān)系的酚酸所形成的酯，其分子內(nèi)具有酯鍵或苷鍵，在稀酸、稀堿或酶的作用下易水解，產(chǎn)生多元醇和小分子類酚酸，根據(jù)其水解產(chǎn)物的不同，分為沒(méi)食子鞣質(zhì)(gallotannin)和鞣花鞣質(zhì)(ellagitannin)兩大類?？s合鞣質(zhì)，即聚黃烷醇類多酚，是由兒茶素或沒(méi)食子酸兒茶素等黃烷－3－醇類化合物以碳－碳鍵聚合而形成的化合物，不被酸所水解，通常三聚體以上才具有鞣質(zhì)的性質(zhì)［4］。

地榆中的鞣質(zhì)類成分量很高，約為17%，從1982 年開(kāi)始，Nonaka、Tanaka 等［5－9］先后從地榆中分離出沒(méi)食子酸、鞣花酸、地榆素 H－1、地榆素 H－2、地榆素 H－3、地榆素 H－6、地榆素 H－11、(± )－兒茶素、(±)－沒(méi)食子酸兒茶素、原花青素 B－3、原花青素 C－2、3－0－沒(méi)食子酰原花青素 B－3、4，6－O－雙沒(méi)食子酰甲基－β－D－吡喃葡萄糖苷、6－O－雙沒(méi)食子酰甲基－β－D－吡喃葡萄糖苷Ⅰ、6－O－雙沒(méi)食子酰甲基－β－D－吡喃葡萄糖苷Ⅱ、2，3，4，6－O－四沒(méi)食子酰甲基－β－D－吡喃葡萄糖苷、2，3，6－O－三沒(méi)食子酰－β－D－吡喃葡萄糖苷和3，4，6－O－三沒(méi)食子酰－β－D－吡喃葡萄糖苷、1，2，3－O－三沒(méi)食子酰－β－D－葡萄糖、1，2，3，6－O－四沒(méi)食子酰－β－D－葡萄糖、2，3，4，6－O－四沒(méi)食子酰－β－D－葡萄糖、1，2，3，4，6－O－五沒(méi)食子酰－β－D－葡萄糖等化合物，夏紅旻、秦國(guó)偉等［10－11］分離出 3，3′，4′－三甲氧基鞣花酸和3－O－甲基沒(méi)食子酸甲酯。

可水解鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)由于基本組成的不同，藥理作用和療效顯著不同，即使同類型的鞣質(zhì)，結(jié)構(gòu)上的微小差異也可導(dǎo)致活性的巨大差異，為了富集地榆中不同類型的鞣質(zhì)類成分進(jìn)行進(jìn)一步的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及藥理活性研究，本實(shí)驗(yàn)以可水解鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)作為研究對(duì)象，分別測(cè)定地榆水提物和各萃取部位的鞣質(zhì)，采用酸解后HPLC分析的方法測(cè)定可水解鞣質(zhì)，用香草醛硫酸法測(cè)定縮合鞣質(zhì)。

1 材料與儀器

1.1 供試材料

地榆干燥藥材，產(chǎn)地廣西，購(gòu)自香港大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院臨床教研中心大藥房，經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與天然藥化實(shí)驗(yàn)室楊得坡教授鑒定為薔薇科地榆屬植物地榆Sanguisorba officinalisL.的干燥根。

1.2 試劑與儀器

TU－1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，HPLC色譜儀:島津LC－20AB泵、島津SIL－20A自動(dòng)進(jìn)樣器、島津SPD－M20A二極管陣列檢測(cè)器(日本島津公司)，Ultimate AQ－C18色譜柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm，美國(guó) Welch 公司)，Millipore超純水系統(tǒng)。

鞣花酸、沒(méi)食子酸、兒茶素(美國(guó)Sigma公司)，色譜純乙腈(美國(guó)Sigma公司)，石油醚(沸程60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、硫酸、香草醛為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 地榆水提物及各個(gè)萃取部位的制備

干燥地榆藥材2.5 kg，粉碎，冷水浸泡過(guò)夜后，加入10倍水(V∶M)、加熱至沸后煎煮1 h，抽濾，濾渣重復(fù)煎煮提取1次，抽濾，合并兩次提取液，得地榆水提液。

將水提液濃縮至小體積后，除小部分濃縮得水提物約120 g，其余依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對(duì)地榆水提液進(jìn)行萃取，萃取液減壓濃縮至干，得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水層留余物，得率如表1所示。因石油醚萃取物的得量很少，且不含鞣質(zhì)類成分，故不對(duì)其進(jìn)行鞣質(zhì)的測(cè)定。

表1 地榆各萃取部位得率Tab.1 The contents of different extracts from Sanguisorba officinalis L.

2.2 地榆水提物及各萃取部位中可水解鞣質(zhì)的測(cè)定

可水解鞣質(zhì)分子內(nèi)的酯鍵或苷鍵在酸熱作用下易水解，產(chǎn)生沒(méi)食子酸和鞣花酸，因此，本實(shí)驗(yàn)采用酸解后HPLC分析的方法［12］，通過(guò)測(cè)定水解后沒(méi)食子酸和鞣花酸，來(lái)間接反映可水解鞣質(zhì)的總量。

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鞣花酸5.22 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，為鞣花酸對(duì)照品貯備液(208.8 μg/mL);精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品5.00 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，為沒(méi)食子酸對(duì)照品貯備液(200 μg/mL)。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取地榆水提物5 mg、乙酸乙酯萃取物 2 mg、正丁醇萃取物 3 mg、水層留余物5 mg，置于5 mL棕色小瓶，加入0.5 mL 2.0 mol/L鹽酸溶液，密封，95℃下酸解8 h。結(jié)束酸解后，冷卻至室溫，加入甲醇超聲30 min，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，為供試品溶液。

2.2.3 色譜條件的選擇 以乙腈和0.2%甲酸－水為流動(dòng)相，乙腈 0 min(5%)－10 min(15%)－25 min(25%)－35 min(30%)－45 min(90%);體積流量 1 mL/min;進(jìn)樣量 20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。在該色譜條件下，沒(méi)食子酸和鞣花酸的保留時(shí)間分別為8.81 min和 27.35 min，沒(méi)食子酸和鞣花酸與樣品中其他組分分離良好，理論塔板數(shù)均大于5 000，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 沒(méi)食子酸、鞣花酸對(duì)照品及乙酸乙酯萃取物酸解后HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of gallic acid，ellagic acid and hydrolyzated ethyl acetate extract

2.2.4 可水解鞣質(zhì)測(cè)定的方法學(xué)考察

2.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 精密吸取0.1、0.25、0.5、0.75、1 、1.5、2、3 mL 鞣花酸對(duì)照品貯備液于5 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制濃度為 5.22、10.44、20.88、41.76、62.64、83.52、125.28 μg/mL 的鞣花酸對(duì)照品系列溶液;精密吸取 0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2mL沒(méi)食子酸貯備液于5 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制濃度為 5、10、20、30、40、50、60、80 μg/mL的沒(méi)食子酸對(duì)照品系列溶液。按2.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，分別以對(duì)照品沒(méi)食子酸、鞣花酸的濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積值Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析。

結(jié)果顯示，鞣花酸濃度在 5.22 ～125.28 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為:Y=167 410X－463 853，r2=0.998 8;沒(méi)食子酸濃度在 5.00 ～80.00 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為:Y=21 461X+23 487，r2=0.999 7。

2.2.4.2 精密度試驗(yàn) 在2.2.3項(xiàng)下色譜條件，分別將鞣花酸和沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得鞣花酸和沒(méi)食子酸峰面積的RSD分別為0.13%和0.04%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取地榆乙酸乙酯萃取物2 mg共6份，按2.2.2項(xiàng)下制備供試液樣品，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)得鞣花酸和沒(méi)食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值分別為57.63 mg/g和149.33 mg/g，RSD分別為0.71%和0.98%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取地榆乙酸乙酯萃取物2 mg，按2.2.2項(xiàng)下制備供試液樣品，配制后分別于第0、1、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣 7 次，按 2.2.3 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)得供試品中的鞣花酸和沒(méi)食子酸峰面積的RSD分別為0.31% 和0.20%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知量的地榆乙酸乙酯萃取物9份，每份約1.2 mg，分別加入不同量的鞣花酸和沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，制備3個(gè)不同濃度的樣品，每個(gè)濃度平行3份，按2.2.2項(xiàng)下制備供試液樣品9份，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示，鞣花酸與沒(méi)食子酸加樣回收率分別為 100.36% 和 102.77%，RSD值分別為1.45%和1.20%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2.5 地榆水提物及各萃取部位中可水解鞣質(zhì)的測(cè)定 分別稱取地榆水提物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層留余物各3份，按照按2.2.2項(xiàng)下制備供試液樣品，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定供試品中沒(méi)食子酸和鞣花酸的量，結(jié)果如表3所示。

2.3 地榆水提物及各萃取部位中縮合鞣質(zhì)的測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取兒茶素對(duì)照品52.59 mg置于50 mL量瓶中，用甲醇溶劑并稀釋至刻度，搖勻，為對(duì)照品貯備液(1.051 8 mg/mL)。

2.3.2 供試品溶液的制備 稱取地榆水提物 5 mg、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物樣品各2 mg，水層留余物50 mg，置于5 mL量瓶中，加入甲醇，超聲溶解后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，為供試品溶液。

2.3.3 縮合鞣質(zhì)測(cè)定方法 采用香草醛硫酸法［13］，取供試品溶液0.5 mL，加入包有錫箔的試管中，分別加入2.5 mL 3%香草醛甲醇溶液和2.5 mL 30%濃硫酸甲醇溶液，搖勻，避光顯色20 min后，在500 nm處測(cè)定吸光度A500。

表2 加樣回收率試驗(yàn)(n=9)Tab.2 Results of recovery test(n=9)

表3 地榆水提物及各萃取部位的可水解鞣質(zhì)測(cè)定Tab.3 Contents of hydrolysable tannins in the aqeous extract of Sanguisorba officinalis L and its different solvents partitioned extracts

2.3.4 縮合鞣質(zhì)測(cè)定的方法學(xué)考察

2.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 精密量取兒茶素對(duì)照品貯備液 0.5、1、2、3、4、5 mL 分別置于 10 mL量瓶中，分別加入甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，備用。分別取上述各濃度對(duì)照品溶液0.5 mL，按2.3.3項(xiàng)下測(cè)定，以對(duì)照品溶液的濃度(X，mg/mL)為橫坐標(biāo)，對(duì)照品吸光度值A(chǔ)500(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。結(jié)果顯示，兒茶素對(duì)照品濃度在0.054 1～0.525 9 mg/mL范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為Y=2.252 3X－0.107 7，r2=0.999 1。

2.3.4.2 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液0.5 mL，按2.3.3項(xiàng)下測(cè)定，連續(xù)測(cè)定 6次 A500，RSD 為0.20%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取1 mg地榆乙酸乙酯萃取物6份，按2.3.2 項(xiàng)下制備供試液，按 2.3.3項(xiàng)下測(cè)定 A500，計(jì)算縮合鞣質(zhì)均值為593.55 mg，RSD為1.70%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取地榆乙酸乙酯萃取物1 mg，按2.3.2項(xiàng)下制備供試液，同一供試品溶液分別于第 0、1、2、4、8、24 h 按 2.3.3 項(xiàng)下測(cè)定A500，共測(cè)定6次，RSD為1.32%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取1 mg已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的地榆乙酸乙酯萃取物9份，分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的兒茶素對(duì)照品溶液，制備3個(gè)不同濃度的樣品，每個(gè)濃度平行3份，按2.3.2項(xiàng)下制備供試液樣品9份，按2.3.3項(xiàng)下測(cè)定A500，結(jié)果如表4所示，兒茶素的加樣回收率為99.37%，RSD值為1.06%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.3.5 地榆水提物及各萃取部位中縮合鞣質(zhì)的測(cè)定 分別稱取地榆水提物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層留余物各3份，按照按2.3.2項(xiàng)下制備供試液樣品，按2.2.3項(xiàng)下測(cè)定A500，結(jié)果如表5所示。

3 討論

3.1 地榆水提物及各個(gè)萃取部位鞣質(zhì)量的差異

由以上結(jié)果可知，所含可水解鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)量高低順序均為:乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞水提物＞水層留余物?？伤怊焚|(zhì)和縮合鞣質(zhì)在乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中量較高，這說(shuō)明乙酸乙酯和正丁醇萃取均可使兩種類型鞣質(zhì)類成分得到富集，尤其是沒(méi)食子鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)的富集效果顯著，乙酸乙酯萃取物中沒(méi)食子鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)的量分別是水提物中量的7.1倍和3.2倍，正丁醇萃取物中沒(méi)食子鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)的量分別是水提物中量的4.9倍和2.6倍。

表4 加樣回收率試驗(yàn)(n=9)Tab.4 Results of recovery test(n=9)

表5 地榆水提物及各萃取部位的縮合鞣質(zhì)測(cè)定Tab.5 Content of condensed tannins in the aqeous extract of Sanguisorba officinalis L and its different solvents partitioned extracts

3.2 地榆不同鞣質(zhì)測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn)

可水解鞣質(zhì)的測(cè)定，采用酸解后HPLC分析的方法，其原理是在酸熱作用下，多酚分子內(nèi)的酯鍵或苷鍵易水解，產(chǎn)生沒(méi)食子酸和鞣花酸，用HPLC法可以準(zhǔn)確測(cè)定多酚水解后生成的酚酸，其優(yōu)點(diǎn)在于準(zhǔn)確度高，靈敏度好，不受其他物質(zhì)的干擾。

縮合鞣質(zhì)的測(cè)定采用香草醛硫酸法，其原理在于酸性條件下黃烷醇類多酚組成單元兒茶素的A環(huán)上的羥基能與香草醛發(fā)生縮合反應(yīng)，在一定濃度范圍內(nèi)，該顯色物質(zhì)在一定的吸收波長(zhǎng)處的吸光度與縮合鞣質(zhì)的濃度成正比，其優(yōu)點(diǎn)在于其線性最好，而且測(cè)量值最接近于標(biāo)準(zhǔn)品的真實(shí)值［14］，經(jīng)過(guò)顯色反應(yīng)條件優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定香草醛甲醇溶液濃度為3%，濃硫酸甲醇溶液濃度為30%，避光顯色20 min為反應(yīng)條件。

2010版中國(guó)藥典中的鞣質(zhì)的測(cè)定方法［15］，其原理是多酚結(jié)構(gòu)中的酚羥基能夠還原鎢鉬酸生成藍(lán)色化學(xué)物質(zhì)，根據(jù)此原理分別測(cè)定總酚與不被吸附的多酚量，鞣質(zhì)量即為總酚與不被吸附多酚的量之差，此法比較穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，因而成為測(cè)定與蛋白結(jié)合鞣質(zhì)量的經(jīng)典方法，但此方法并不能區(qū)分可水解鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)。

本試驗(yàn)采用的酸解后HPLC分析和香草醛硫酸法分別測(cè)定兩種不同類型鞣質(zhì)的量，方法簡(jiǎn)便、快速、精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、專屬性好，適合作為中藥或天然藥物中不同類型鞣質(zhì)的測(cè)定方法。

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