薛 楠， 薛 敬， 林鵬程

(青海民族大學化生院，青海西寧 810007)

手掌參GymnadeniaconopseaR.Br.又名佛手參、手參、掌參，是蘭科Orchidaceae手參屬一種多年生草本植物，因其地下根莖形似手掌而得名，主要生長在青藏高原海拔2 700～4 000 m范圍內(nèi)無污染的灌木叢中，為常用名貴藏藥［1-2］。手掌參味甘，性溫，具有增力生精、溫腎暖腎、大補元氣、安神增智等功效。尤其對陽痿、腎寒有益，具有很高的藥用價值，因而有“不老草”之稱［3-6］。天麻素是手掌參主要有效成分之一［7］，現(xiàn)代藥理研究表明，天麻素具有鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗衰老、增加心腦血流量、改善學習記憶力等作用［8］。為了有效控制藥材的質(zhì)量［9］，本實驗建立了青藏高原不同地區(qū)手掌參中天麻素含量的高效液相色譜測定方法。該方法快速、簡便、準確、重復性好，不僅適用于手掌參原藥材的質(zhì)量控制，還可供手掌參制劑借鑒。

1 儀器與材料

Agilent 1100高效液相色譜儀(配置手動進樣器，在線脫氣機，高壓二元梯度泵，恒溫柱溫箱，DAD檢測器，Agilent 1100色譜工作站);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);FZ102微型植物試樣粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。實驗用試劑甲醇為高效液相色譜專用試劑(山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠);水為自制三重蒸餾水;磷酸為AR級(北京紅星化工廠);天麻素對照品由本課題組分離鑒定，純度大于99% 。手掌參樣品系2009年9月采于青藏高原不同地區(qū)，由青海民族大學藥學系林鵬程教授鑒定，樣品陰干后粉碎過80目篩，冷藏保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱 Hypersil ODS-2(4.6 mm ×250 mm，5 μm)柱;流動相甲醇-水(含0.04%的磷酸)=8∶92;體積流量1 mL/min;檢測波長222 nm;柱溫30℃，進樣量20 μL。該色譜條件下天麻素被洗脫且達到基線分離，保留時間為9.21 min(見圖1)。

2.2 溶液配制

精密稱取天麻素對照品3.50 mg置10 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，配制成對照品溶液。精密稱取手掌參樣品粉末1.0 g，加入50%的甲醇15 mL，熱回流提取2 h，抽濾，濾渣重復處理1次，合并濾液，濃縮后定容至25 mL量瓶中，過0.45 μm 濾膜，即得樣品溶液。

2.3 線性關(guān)系

精密量取天麻素對照品溶液適量，用甲醇準確稀釋成下列濃度:0.070、0.140、0.210、0.280、0.350 和0.420 g/L 的系列對照品稀釋液，取各稀釋液進樣20 μL，記錄峰面積。以峰面積(A)為縱坐標，進樣量C(μg)為橫坐標，得天麻素的回歸方程為:A=512.91C+0.35，r=0.999 9。線性范圍為:1.400 ～8.400 μg。當信噪比 S/N=3 時，天麻素的檢測限為0.32 ng。

圖1 天麻素對照品(A)和手掌參樣品(B)HPLC圖1.天麻素

2.4 精密度實驗

精密吸取濃度為0.210 g/L的天麻素對照品稀釋液20 μL，在2.1項色譜條件下重復進樣5次，記錄峰面積，計算RSD為0.41%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性實驗

精密稱取手掌參樣品1.0 g共5份，分別按2.2項下方法制備成樣品溶液，然后在2.1項色譜條件下測定天麻素，計算得RSD為1.4%(n=5)，表明方法重復性良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取新配制的樣品溶液，分別在 0、2、4、6、8 h時進樣，測定天麻素的峰面積，計算得RSD為1.3%(n=5)，表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收率實驗

精密稱取已測定的手掌參(3#樣品)1.0 g共9份，分為3組，每組3份，分別添加低、中、高3種濃度的天麻素對照品液適量，按2.2項下方法操作，測得天麻素平均回收率(n=9)為99.14%，RSD 為0.69%。結(jié)果見表1。

2.8 樣品測定

取2.2項下制備的青藏高原不同地區(qū)手掌參樣品溶液按2.1項色譜條件進行分析，經(jīng)DAD檢測器驗證天麻素的峰純度后，按外標法以峰面積計算，得青藏高原不同地區(qū)手掌參樣品中天麻素的量(n=3)。結(jié)果見表2。

表1 天麻素回收率測定結(jié)果

表2 青藏高原不同地區(qū)手掌參中天麻素的測定

3 討論

3.1 樣品提取方法的確定［10］

考察冷浸、超聲和熱回流對手掌參中天麻素的量的影響，結(jié)果熱回流提取率最高。又分別以水、甲醇、乙醇為溶劑，考察不同溶劑對分析結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇對天麻素提取率最高。利用正交試驗進一步考察不同濃度甲醇、不同溶劑量、不同提取時間和提取次數(shù)對天麻素的量的影響，方差分析結(jié)果表明，天麻素提取率的影響因素依次為:甲醇濃度＞提取時間＞溶劑量＞提取次數(shù)?？紤]實際工作的方便、快捷，經(jīng)進一步試驗，確定最佳提取方法為甲醇濃度50%，溶劑量15 mL，提取時間2 h，提取次數(shù)2次。

3.2 流動相的選擇

天麻素色譜峰易拖尾，經(jīng)試驗，當在水中加入0.01% ～0.10%磷酸時可改善天麻素峰形。最終選擇甲醇和含0.04%的磷酸水溶液(8∶92)為流動相。

3.3 檢測波長的確定［11］

利用DAD檢測器在200～400 nm掃描對照品溶液的吸收光譜，結(jié)果在222 nm處有最大吸收，因此選擇該波長為檢測波長。

3.4 測定結(jié)果分析

青藏高原不同地區(qū)藏藥手掌參中天麻素測定的結(jié)果顯示，手掌參中天麻素質(zhì)量分數(shù)在2.268～9.113 mg/g之間，含量有較大差異，其中以同德縣手掌參中天麻素中的量為最高。

［1］楊永昌.藏藥志［M］.西寧:青海人民出版社，1995:246.

［2］中國科學院西北高原生物研究所.青海植物志:第4卷［M］.西寧:青海人民出版社，1999:295-318.

［3］青海省藥品檢驗所，青海省藏醫(yī)藥研究所.中國藏藥:一卷［M］.上海:上海科學技術(shù)出版社，1996:341-344.

［4］李 敏，王春蘭，郭順星，等.手參屬植物化學成分及藥理活性研究進展［J］.中草藥，2006，37(8):1264-1268.

［5］覃筱燕，云妙英，唐 麗，等.藏藥旺拉的化學成分及藥理活性的研究進展［J］.中央民族大學學報:自然科學版，2007，16(3):229-232.

［6］Matsuda H，Morikawa T，Xie H H，et al.Antiallergic phenathrenes and stilbene from the tubers of Gymnaenia conopsea［J］.Planta Med，2004，70(9):847-855.

［7］訾佳辰.手參的化學成分研究［D］.中國協(xié)和醫(yī)科大學，2008.

［8］何 晶.天麻素的藥理作用及臨床應用［J］.天津藥學，2006，18(5):62-63.

［9］楊蓓蓓，李 帥，張瑞萍，等.HPLC測定藏藥手掌參旺拉中4種有效成分的含量［J］.中國中藥雜志，2009，34(14):1819-1822.

［10］林鵬程，王永菊，祝存恩，等.青海不同地區(qū)藏藥麻花艽中環(huán)烯醚萜苷類成分的含量測定與品質(zhì)評價［J］.中國藥學雜志，2006，41(10):783-785.

［11］伍振峰，何 偉，馬建春.天麻中天麻素含量測定方法改進的研究［J］.中成藥，2009，31(6):966-967.