韓曉萍， 葉正良， 王薇丹， 李德坤， 周大錚， 林瑞超， 劉麗芳

(1.青海省藥品檢驗所，青海西寧 810000;2.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，天津 300402;3.中國藥品生物制品檢定所，北京 100150;4.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198)

中藥制劑化學(xué)成分復(fù)雜，種類繁多，本身又多為大分子物質(zhì)，這些大分子如蛋白質(zhì)、多肽、糖、鞣質(zhì)、果膠等既有免疫原性，又具有免疫反應(yīng)性，因此具有致敏的可能性［1］。中藥注射劑直接作用于靜脈，起效快，但是一旦有副作用，就會產(chǎn)生嚴(yán)重的后果［2］。2009年7月，國家食品藥品監(jiān)督管理局出臺了《中藥注射劑安全性再評價質(zhì)量控制要點(diǎn)》，明確要求對于具體品種的工藝條件下可能存在、而質(zhì)量研究中未檢出的大類成分，應(yīng)建立排除性檢查方法，必要時，應(yīng)建立高分子量物質(zhì)檢查項。注射用益氣復(fù)脈(凍干)是在傳統(tǒng)古方生脈散的基礎(chǔ)上研制而成的新型中藥制劑，由紅參、麥冬和五味子組方而成，具有益氣生津、斂陰止汗的功效。本研究正是基于這一要求展開，建立了一種簡便快捷的方法檢測注射用益氣復(fù)脈(凍干)中的大分子物質(zhì)。確保制劑的安全性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，G1310A單元泵，G1322A在線脫氣機(jī)，G1313A自動進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1362A示差檢測器，Mettle Toledo XS105電子天平。

1.2 試藥 右旋糖苷對照品(Dextran Standard，相對分子質(zhì)量分別為 180，2 500，4 600，7 100，10 000，21 400，41 100，84 400，133 800。中國藥品生物制品檢定所，批號2000-01)。水為重蒸水，氯化鈉為分析純。注射用益氣復(fù)脈(凍干)5批(批號分別為20080201、20080402、20080702、20090204、20090302、天津天士力之驕藥業(yè)有限公司提供)，氯化鈉注射液(批號:9G71C，中國大冢制藥有限公司，市售)。

2 方法與結(jié)果［3］

2.1 色譜條件 色譜柱為 Ultrahydrogel 250(7.8 mm×300 mm);流動相0.1 mol/L氯化鈉溶液;體積流量0.3 mL/min;柱溫30℃;示差折光檢測器40℃。進(jìn)樣量20 μL。

2.2 專屬性和線性考察 精密稱取上述9份對照品用氯化鈉注射液配制成各約1 mg/mL的溶液，同時取氯化鈉注射液作空白對照溶液，分別進(jìn)樣，按上述條件測試，圖譜見圖1。以保留時間tR為橫坐標(biāo)，右旋糖酐分子質(zhì)量的lgMW為縱坐標(biāo)［4］進(jìn)行回歸處理，得線性回歸方程為:lgMW= －0.208 6tR+8.918，r=0.991，測定結(jié)果見表1。

圖1 9種不同分子質(zhì)量右旋糖酐對照品及空白對照的液相圖譜Fig.1 Chromatogram of nine molecular weight dextrans and background

表1 9種不同分子量右旋糖酐對照品的保留時間Tab.1 tRof nine molecular weight dextrans

結(jié)果表明:空白對照溶液在相應(yīng)的保留時間處均無干擾，右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液在相對分子質(zhì)量180～133 800范圍內(nèi)相對分子質(zhì)量與保留時間呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度考察 精密稱量相對分子質(zhì)量為4 600和10 000的右旋糖酐對照品，分別用氯化鈉注射液溶解定容，得濃度為1.96 mg/mL和2.07 mg/mL的溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，測定保留時間，計算RSD，結(jié)果相對分子質(zhì)量為4 600的右旋糖酐保留時間的RSD為0.83%，相對分子質(zhì)量為10 000的RSD為1.06%。表明此方法的精密度良好。

2.4 最低檢出限 取上述配制的右旋糖苷4 600和1 000對照品溶液，分別稀釋至10倍、120倍、200倍、400倍、500倍，進(jìn)樣分析，色譜圖見圖2。

圖2 不同濃度2種右旋糖苷最低檢測限對照品色譜圖Fig.2 The limit of detection of two dextrans

結(jié)果表明，二者在稀釋到500倍時，樣品峰消失，故可判斷右旋糖苷對照品的最低檢出限為約4 μg/mL。

2.5 穩(wěn)定性考察 取上述兩種右旋糖酐對照品溶液，分別放置0、2、4、8 h后按上述條件進(jìn)樣測定，計算保留時間的RSD，結(jié)果相對分子質(zhì)量為4 600的右旋糖酐保留時間的RSD為0.57%，相對分子質(zhì)量為10 000的 RSD為0.72%，表明此方法的穩(wěn)定性良好。

2.6 樣品測定 分別取5批注射用益氣復(fù)脈(凍干)用氯化鈉注射液配制成濃度約為1.0 mg/mL的溶液，微孔濾膜濾過，20 μL進(jìn)樣測定。樣品色譜圖見圖3。

圖3 5批注射用益氣復(fù)脈(凍干)的測定色譜圖Fig.3 Chromatogram of five batches of injection(freeze-drying)

結(jié)果表明所測5批注射用益氣復(fù)脈(凍干)樣品的出峰時間均高于30 min，可判斷樣品中無大分子物質(zhì)或含量極低。

2.7 樣品穩(wěn)定性考察 精密稱取批號為20080201注射用益氣復(fù)脈(凍干)，用氯化鈉注射液溶解并定容至 0.65 mg/mL。分別考察在 0、2、4、8 h 放置后樣品在注射用氯化鈉注射液中的穩(wěn)定性。所測液相圖譜見圖4。

圖4 樣品在輔助注射液中的穩(wěn)定性Fig.4 Stability of sample in auxiliary injection

結(jié)果表明:樣品溶解于氯化鈉注射液中后在8 h內(nèi)測定沒有出現(xiàn)大分子物質(zhì)，樣品在此輔助注射溶劑中穩(wěn)定性良好。

2.8 結(jié)果 依據(jù)凝膠色譜的分離原理:相同實(shí)驗條件下，物質(zhì)的分子質(zhì)量越大，保留時間越短;分子質(zhì)量越小，保留時間越長［5］。示差折光檢測器是高度穩(wěn)定和靈敏的液相色譜和凝膠滲透色譜檢測器，可用于檢測在紫外光范圍內(nèi)吸光度不高的化合物，如聚合物、糖、有機(jī)酸和甘油三酸酯［6］。示差折光檢測器的偏轉(zhuǎn)式設(shè)計，能夠?qū)δ切┚哂械驮胍艉臀灰铺匦缘幕衔镞M(jìn)行靈敏的檢測。從HPLC圖譜中可知所測5批注射用益氣復(fù)脈(凍干)樣品出峰時間高于30 min，可判斷注射用益氣復(fù)脈(凍干)中無大分子物質(zhì)或含量極低。

3 分析與討論

3.1 對于中藥注射劑中的大分子物質(zhì)的排除性檢測方法的確立，目前尚無法規(guī)性的方法可參照，本研究中的方法學(xué)驗證以《中國藥典》2010版一部附錄ⅩⅧ中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則為基礎(chǔ)。

3.2 中藥注射劑致機(jī)體過敏物質(zhì)很多，一般分為完全抗原和半抗原兩種，完全抗原多為大分子物質(zhì)，相對分子質(zhì)量大于10 000，如動物蛋白、多肽等，進(jìn)入人體內(nèi)能直接使人體致敏;半抗原為小分子化學(xué)物質(zhì)，而大多數(shù)中藥為低分子質(zhì)量化合物，進(jìn)入人體后必須先與某些大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)等作為載體相結(jié)合，才能形成半抗原-載體復(fù)合物，引起機(jī)體對該種藥物的特異性免疫反應(yīng)［7-9］。故本研究中選擇相對分子質(zhì)量為5 000(實(shí)際為4 600)和10 000的兩個右旋糖酐對照品做方法學(xué)驗證。

3.3 因為是大分子物質(zhì)的排除性檢測，故在本研究中對精密度、最低檢測限和穩(wěn)定性的考察均用對照品的相應(yīng)測定表示。

3.4 注射用益氣復(fù)脈(凍干)在臨床使用時規(guī)定用氯化鈉注射液做輔助注射劑，故本研究中選擇用氯化鈉注射液做相應(yīng)溶劑和空白對照。

3.5 分別比較了0.1 mol/L氯化鈉溶液、0.7%硫酸鈉溶液、0.1%疊氮化鈉作流動相之后，在以氯化鈉注射液做溶劑時0.1 mol/L氯化鈉溶液做流動相效果更好［4，10］。

3.6 本研究附帶考察了樣品在輔助注射劑中溶解之后的穩(wěn)定性，以說明樣品在用氯化鈉注射液中溶解后8 h內(nèi)沒有發(fā)生聚凝和沉淀等變化。

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