付計瑞, 滕 亮*, 戴秀勇, 于富生
(1.新疆醫(yī)科大學藥學院,新疆烏魯木齊 830054;2.新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司,新疆烏魯木齊 830011)
駱駝蓬為駱駝蓬屬Peganum蒺藜科Zygophyllaceae多年生草本植物,全世界共6種,我國有3種。駱駝蓬屬植物在我國作為民間藥或民族藥使用已有很長的歷史,資源豐富蘊藏量大[1-3]。根據(jù)《衛(wèi)生部藥品標準維吾爾藥分冊》記載[4]:駱駝蓬子具有堅固筋脈,助陽暖陰,清除黏稠體液,消散寒濕之氣的功能,用于偏癱健忘,神昏頭痛等癥狀。國外則早在19世紀就有將駱駝蓬子生物堿用于治療帕金森病和老年性癡呆癥的臨床報道[5]。駱駝蓬全草含有生物堿、甾體、黃酮、蒽醌、氨基酸等成分[6]。其中生物堿種類最多,其量在植株中分布依次為種子>根>種殼>莖>葉。國內(nèi)目前研究較為集中的方向為駱駝蓬總堿及駱駝蓬生物堿單體抗腫瘤方面,但對于其生物堿的中樞作用多認為是毒副作用?;谀嫦蛩季S法,同時結(jié)合老年癡呆病機的最新學說與駱駝蓬堿作用于中樞的機理描述,課題組認為駱駝蓬的中樞毒副作用很有可能用于老年癡呆的干預與治療。前期預實驗表明駱駝蓬總堿的中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用具有明確的劑量依賴性,通過調(diào)整給藥劑量可減低其中樞毒性。本實驗以駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿總含量為工藝優(yōu)選指標,采用均勻試驗設(shè)計優(yōu)選新疆駱駝蓬種子中駱駝蓬總堿的提取工藝與純化工藝,并評價了駱駝蓬總堿提取物對三氯化鋁造成的老年癡呆小鼠的預防和治療作用,以及為該藥材的后續(xù)開發(fā)奠定一定的試驗基礎(chǔ)。
1.1 儀器 高效液相色譜儀(Laballiance PC-2005系統(tǒng));分析天平(FA1004 HENGPING);天孚牌系列電子天平(常熟市金羊砝碼儀器有限公司);MGB型迷宮刺激器(張家港市三興教學機械廠);LS3120超聲儀(BENCHTOP CLEANERS);CLDZX-40SC型立式自控電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);注射器(上海寶島醫(yī)用器材有限公司批號:20090817);KMD型調(diào)溫電熱套(山東省鄴城永興儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE-52A(上海亞榮生化儀器廠);SH2-D循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);D2H-200型真空干燥箱(上海圣欣科學儀器有限公司)。
1.2 試劑 駱駝蓬種子、去氫駱駝蓬堿由新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司提供,經(jīng)于富生副主任藥師鑒定。去氫駱駝蓬堿對照品(百靈威化學技術(shù)有限公司,批號:302972500,純度:98%);駱駝蓬堿對照品(Fluka,批號:2061526,純度:98%);無水 AlCl3(上海山浦化工有限公司,批號:20040517);生理鹽水(新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司,批號:10030615);石杉堿甲片(河南太龍藥業(yè)股份有限公司,批號:091102);鹽酸(西安化學試劑廠,批號:0908103);乙醇(安徽安特生物化學有限公司出品,批號:0708093601);色譜甲醇(Tedia,批號:904902);二乙胺(天津市光復精細化工研究所,批號:2006819);硫酸銨(北京化學試劑廠,批號:801003);甲醇(西安化學試劑廠,批號:0908101)。
1.3 實驗動物 昆明種小鼠,購于新疆疾病控制中心,許可證號:SCXK(新)2003-002,3 月齡(30 ~35 g),雌雄各半,共350只。
2.1 駱駝蓬總堿提取純化工藝的研究
2.1.1 優(yōu)選指標 以提取物中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的量之和為優(yōu)選指標來確定提取工藝。
2.1.1.1 樣品中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的含量測定 色譜條件為:流動相:甲醇-0.01 mol/L硫酸銨溶液-二乙胺(70∶30∶0.4);柱溫:30℃;體積流量:0.5 mL/min;檢測波長:320 nm(去氫駱駝蓬堿);372 nm(駱駝蓬堿);進樣量:10 μL。
對照品溶液的制備:精密稱取駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿各10 mg,置于25 mL量瓶中,用0.1 mol/L鹽酸,超聲溶解,并加鹽酸至刻度,精密吸取1 mL,置于10 mL量瓶中,加鹽酸至刻度,搖勻,即得。
供試品溶液的制備:精密稱取干浸膏20 mg(駱駝蓬總堿純化物10 mg),置于25 mL量瓶中,用0.1 mol/L鹽酸,超聲溶解,并加至刻度,精密吸取1 mL,置于10 mL量瓶中,加鹽酸至刻度,搖勻,即得。
目前律師調(diào)解存在的問題很大程度在于各方利益訴求的不一致,這需要建立正向引導和激勵機制,平衡各方利益,實現(xiàn)多方共贏。
2.1.1.2 駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿含量測定的方法學考察 方法學考察表明駱駝蓬堿在0.004 35~0.278 4 mg/mL之間的質(zhì)量濃度與峰面積呈線性關(guān)系(r=0.999 5),重復性試驗 RSD 為1.5%,精密度試驗RSD為0.50%,穩(wěn)定性考察表明樣品中駱駝蓬堿在24 h內(nèi)穩(wěn)定,方法平均加樣回收率RSD為0.80%。
去氫駱駝蓬堿在0.003 15~0.201 6 mg/mL之間的質(zhì)量濃度與峰面積呈線性關(guān)系(r=0.999 5),重復性試驗RSD為1.3%,精密度試驗RSD為1.38%,穩(wěn)定性考察表明樣品中駱駝蓬堿在24 h內(nèi)穩(wěn)定,方法平均加樣回收率RSD為1.1%。去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿對照品與供試品色譜圖見圖1~4。
圖1 去氫駱駝蓬堿對照品色譜圖
圖2 供試品色譜圖
2.1.2 駱駝蓬總堿粗提物提取工藝的研究
2.1.2.1 均勻試驗設(shè)計優(yōu)選駱駝蓬總堿粗提物的提取工藝 預試驗與文獻調(diào)研表明影響駱駝蓬堿提
圖3 駱駝蓬堿對照品色譜圖
取效果的主要因素有提取時間、乙醇濃度、乙醇用量,而提取次數(shù)、浸泡時間的影響不顯著,因此選用U7(73)均勻設(shè)計表安排試驗,因素水平見表1。稱取駱駝蓬種子(20目篩)粉末50 g,按表2進行試驗,采用乙醇回流法提取浸膏,并測定干浸膏中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿,結(jié)果見表2。
表1 均勻試驗因素水平
表2 U7(73)均勻試驗結(jié)果
將試驗結(jié)果采用均勻設(shè)計回歸分析及優(yōu)化系統(tǒng)(UROS)進行處理,得回歸方程:Y=1.047 8+0.051 8X1-0.004 2X2+0.062 7X3,方程顯著性檢驗:F=183.675,標準差 S=0.030 8,復相關(guān)系數(shù) R2=0.997 3,方程顯著(P<0.05)。
2.1.2.2 驗證試驗 稱取駱駝蓬種子(20目篩)粉末50 g 3份,加30%的乙醇4倍量,提取7 h。干燥得干浸膏。測定含量,結(jié)果見表3。
表3 駱駝蓬總堿提取工藝驗證試驗
3 份提取實驗的平均值為(1.881 ±0.023)g,RSD為1.2%,說明優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定、合理、可行。
2.1.3 駱駝蓬總堿純化工藝的研究
2.1.3.1 均勻試驗設(shè)計優(yōu)選駱駝蓬總堿的純化工藝 采用酸溶堿沉法對駱駝蓬總堿粗提物進行純化。
預試驗與文獻調(diào)研表明影響酸溶堿沉效果的主要因素有加酸量、酸濃度、氨水調(diào)pH、超聲時間,因此選用U7(74)均勻設(shè)計表安排試驗,因素水平見表4。稱取駱駝蓬總堿干浸膏5 g,按表5進行試驗,并測定純化物中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿,結(jié)果見表5。
表4 因素水平
表5 U7(74)均勻?qū)嶒灠才偶敖Y(jié)果
將試驗結(jié)果采用均勻設(shè)計回歸分析及優(yōu)化系統(tǒng)(UROS)進行處理,得回歸方程:Y=8.871 7-0.065 9X2-1.789 4X3- 0.000 2X21+0.094 3X23-0.000 1X24,F(xiàn)=999 999.99,標準差 S=0.000 3,復相關(guān)系數(shù) R2=1.000 0,方程顯著(P<0.05)。
優(yōu)化條件為:X1加酸量(倍)為4.15;X2酸濃度(%)為0.603%;X3氨水調(diào)pH為9;X4超聲時間(min)為10;理論最大值為:0.421 g,預測區(qū)間為0.420 2 ~0.422 5 g。
2.1.3.2 驗證試驗 稱取駱駝蓬總堿浸膏5 g 3份,加0.5%的鹽酸4倍量超聲10 min溶解,氨水調(diào)pH為9,放置24 h。過濾,干燥。得駱駝蓬總堿,測定結(jié)果見表6。
表6 駱駝蓬總堿純化工藝驗證試驗
3份提取實驗總堿量的平均值為(0.444 6±0.002)g,RSD 為0.4%,說明優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定、合理、可行。
2.2 駱駝蓬總堿對鋁致老年癡呆小鼠的作用
2.2.1 動物分組和給藥 將350只昆明種小鼠(雌雄各半,體質(zhì)量30~35 g),隨機分為5組,分別為空白對照組(生理鹽水)、鋁致癡呆小鼠模型組(100 mg/kg 三氯化鋁)[7-8]、石杉堿甲片陽性對照組(50 mg/kg石杉堿甲片+100 mg/kg三氯化鋁)、去氫駱駝蓬堿組(33 mg/kg去氫駱駝蓬堿+100 mg/kg三氯化鋁)、駱駝蓬總堿組(33 mg/kg駱駝蓬總堿+100 mg/kg三氯化鋁)。先進行三氯化鋁腹腔注射,隔日一次,連續(xù)注射50 d,以復制慢性鋁中毒AD模型。第5天開始除模型組外其他各組灌胃給藥,每天1次。
2.2.2 小鼠行為學測試結(jié)果 小鼠在第49天進行學習,第50天進行測試,觀察小鼠走出迷宮的的正確次數(shù)。Y型迷宮:該裝置一般分成3等分,分別稱之為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ臂。分別設(shè)置為安全區(qū),電擊區(qū),起步區(qū)。訓練時將小鼠獲得遭遇電擊直接逃避至安全區(qū)視為正確反應,反之為錯誤反應,固定訓練次數(shù)12次,24 h后測試記憶成績。結(jié)果進行統(tǒng)計學處理,見表7。
3.1 駱駝蓬種子中含有多種生物堿,其中β-咔波啉類生物堿量居多。目前研究比較系統(tǒng)的β-咔波啉類生物堿為駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿。文獻調(diào)研[9]表明駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿對大腦皮層及運動中樞、脊髓和腦橋等有興奮作用,同時也是腦中單胺氧化酶抑制劑和5-羥色胺受體的抑制劑。結(jié)合老年癡呆病機的最新學說,課題組認為駱駝蓬種子中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿應為該藥材抗老年癡呆的主要物質(zhì)基礎(chǔ),因此以駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿為提取與純化的目標對象。通過提取純化工藝研究可以實現(xiàn)純化物中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的總質(zhì)量分數(shù)超過50%。
表7 鹽酸去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬總堿對鋁致癡呆小鼠的保護作用
3.2 老年癡呆小鼠模型試驗結(jié)果表明:(1)模型組與空白對照組的正確次數(shù)存在顯著差異(P<0.05),說明模型復制成功;(2)陽性對照組、鹽酸去氫駱駝蓬堿組與空白對照組的正確次數(shù)存在顯著差異(P<0.05),同時與模型組的正確次數(shù)也存在顯著差異(P<0.05),說明石杉堿甲與鹽酸去氫駱駝蓬堿對于鋁致癡呆小鼠的記憶力有一定的保護作用,但保護結(jié)果與正常小鼠記憶力仍有區(qū)別;(3)駱駝蓬總堿組與空白對照組的正確次數(shù)未出現(xiàn)統(tǒng)計學差異(P>0.05),說明駱駝蓬總堿對于鋁致癡呆小鼠的記憶力有較好保護作用;(4)從動物存活率也可以看出駱駝蓬總堿在對小鼠的生存保護方面有更為理想的效果。
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