閔 勇， 張 薇， 王 洪， 姚立華， 劉 衛(wèi)*

(1.紅河學(xué)院云南省天然藥物與化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南蒙自 661100;2.云南省紅河州公安局刑事技術(shù)偵查處，云南蒙自 661100)

斷腸草學(xué)名鉤吻(Gelsemium elegansBenth)，為馬錢科(loganiaceae)胡蔓藤屬植物。斷腸草主要含有生物堿、萜類等化學(xué)成分［1－3］。活性研究證實(shí)斷腸草生物堿具有免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗腫瘤等多種藥用功效［4－6］。前人對斷腸草生物堿的提取工藝做過研究［7－8］，但是，由于斷腸草生物堿組分復(fù)雜，不易在工藝研究中對生物堿的得率準(zhǔn)確定量。本文以云南省紅河州地區(qū)產(chǎn)斷腸草為研究對象，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，通過酸性染料比色法測定斷腸草中鉤吻素子類生物堿含量，對生物堿浸提工藝進(jìn)行評價(jià)，為開發(fā)地方藥用植物資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

斷腸草(Gelsemium elegansBenth)采集于云南省綠春縣黃連山(經(jīng)紅河學(xué)院生命科學(xué)院 田學(xué)軍教授鑒定);鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)品(采購于德國Dr.Ehrenstorfer公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)UV3802(優(yōu)尼柯)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N－1100V－W型 (東京理化)、高速萬能粉碎機(jī)FW80(上海安銳自動(dòng)化儀表有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 生物堿含量測定

采用酸性染料比色法［9］

配制鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)溶液 稱取標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，溶解，用無水乙醇定容于25 mL量瓶中。取1 mL溶液稀釋10倍，得鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 μg/mL)。分別精密吸取此對照品溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 置于試管中依次加入5.0 mL pH為4.0的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液，2.0 mL溴甲酚綠酸性染料溶液，5.0 mL氯仿，搖勻，倒入分液漏斗中靜置1 h，分取氯仿層，掃描最大吸收波長為414 nm(文獻(xiàn)報(bào)道為410 nm)。在此波長下測定吸光度，以鉤吻素子濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得以下線性方程:Y=0.155 8+0.009 7X，r=0.998 2。

1.3.2 斷腸草生物堿的提取

取斷腸草1 kg粉碎(30～40目)，加入1 000 mL 3%氫氧化鈉溶液拌勻、陰干。采用文獻(xiàn)方法［10］制成藥粉。每次實(shí)驗(yàn)取5g藥粉，按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行浸提，浸提液抽濾得濾液，濾液減壓蒸餾濃縮至總體積一半，吸取濾液2 mL無水乙醇定容于25 mL量瓶中，取2 mL溶液按照1.3.1項(xiàng)方法測定吸光度，計(jì)算鉤吻素子含量。

1.3.3 生物堿得率計(jì)算公式

ωB……總生物堿得率(%)

ms……生物堿質(zhì)量(g)(以鉤吻素子計(jì))mc……斷腸草藥粉質(zhì)量(g)

1.3.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)確定影響提取效果的主要因素及水平，然后利用正交試驗(yàn)對斷腸草生物堿提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑對生物堿堿提取率的影響

斷腸草藥粉5 g，按固液比1∶10(體積比)分別加入60%、70%、80%、90%的乙醇、氯仿做為浸提溶劑，在30°C加熱回流，提取2次，每次2 h(表示為2 h×2)，合并浸提液，測定生物堿含量，考察溶劑對生物堿提取率的影響，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，在醇水混合溶劑中80%乙醇對生物堿的提取率最高，略低于氯仿提取率。考慮環(huán)保及生產(chǎn)成本因素，選擇80%乙醇進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 溶劑對生物堿得率的影響

2.2 浸提溫度對生物堿提取率的影響

斷腸草藥粉5 g，按1∶10的固液比加入80%乙醇，分別在30、40、50、60 °C溫度下浸提2h ×2，考察溫度對生物堿提取率的影響，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，自30°C開始，生物堿提取率隨浸提溫度而增大。達(dá)到50°C后，生物堿提取率呈下降趨勢。這是由于溫度高于50°C時(shí)，斷腸草中雜質(zhì)的溶出量加大，與總生物堿競爭溶劑，使斷腸草總堿提取率降低。選擇50°C為考察溫度。

圖2 浸提溫度對生物堿得率的影響

2.3 浸提時(shí)間對生物堿提取率的影響

斷腸草藥粉5 g，按1∶10的固液比加入80%乙醇，在50 °C分別浸提2 h×2、3 h×2、4 h×2、5 h×2、6 h×2 考察浸提時(shí)間對生物堿提取率的影響，結(jié)果見圖3。數(shù)據(jù)顯示生物堿得率隨浸提時(shí)間的延長而增加，超過4 h×2后，生物堿得率隨浸提時(shí)間變化率趨于平緩，而且浸提時(shí)間過長會(huì)增加可溶性雜質(zhì)的濃度，為后續(xù)分離純化帶來困難。因此，選定4 h×2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 浸提時(shí)間對生物堿得率的影響

2.4 固液比對生物堿提取率的影響

斷腸草藥粉5 g，按不同的固液比加入80%乙醇，在50°C浸提4 h×2、考察浸固液比對生物堿提取率的影響，結(jié)果見圖4。圖中顯示，生物堿得率隨固液比增加而升高，當(dāng)固液比達(dá)到1∶20后，生物堿的得率增加趨勢平緩，而過大的固液比會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi)，并增大后續(xù)濃縮的工作量。因此，選擇固液比1∶20為正交設(shè)計(jì)考慮因素。

圖4 固液比對生物堿得率的影響

2.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化生物堿提取條件

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)L9(34)，對影響斷腸草生物堿提取率的4個(gè)主要影響因素:溶劑、浸提溫度、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行研究，以便進(jìn)一步優(yōu)化斷腸草生物堿提取條件，見表1。各因子編碼值及試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果分別見表2和表3。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子及編碼值

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果表明，各處理間的差異顯著(P＜0.05)。對各因素進(jìn)行回歸分析可知，A(P＜0.01)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最顯著。根據(jù)表3的結(jié)果得出擬合方程(1)，模擬的擬合性能良好(R2=93.60%)。從方程可知，A和C的系數(shù)為正，B和D的系數(shù)為負(fù)，說明實(shí)驗(yàn)所選擇的零水平處，Y值隨浸提溫度的升高、浸提時(shí)間的延長、乙醇濃度和固液比的降低而增大。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在第7組實(shí)驗(yàn)(A1B－1C1D0)條件下生物堿得率最高為0.654%，而極差分析結(jié)果顯示最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為(A1B0C1D0)。進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在A1B0C1D0條件下生物堿得率為0.639%低于0.654%。因此，斷腸草生物堿的最佳提取條件是A1B－1C1D0:提取溫度為55℃、溶劑濃度為75%、提取時(shí)間為4.5 h×2、料液比為1∶20。

3 結(jié)論

3.1 通過對正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知提取溫度和浸提時(shí)間對斷腸草生物堿提取率影響最為顯著，在以后的研究中應(yīng)該重點(diǎn)研究提取溫度和浸提時(shí)間對生物堿提取的影響。

3.2 本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化得出了從斷腸草中提取生物堿的最佳條件:提取溫度為55℃、溶劑濃度為75%、提取時(shí)間為4.5 h×2、料液比為1∶20。在該條件下從斷腸草中生物堿提取率可達(dá)0.654%。

［1］Kogure N，Ishil N，Kitajima M，et al.Four novel gelsenicine－related oxindole alkaloids from the leaves of gelsemium elegans［J］.Org.Lett，2003，8(14):3085－3088.

［2］Xu Y K，Yang S P，Liao S G，et al.Alkaloidsfrom gelsemium elegans［J］.J Nat Prod，2006，69(9):1347－1350.

［3］Kitajima M，Kogure N，Yamaguchi K，et al.Structure reinvestigation of gelsemoxonine，a constituent of gelsemium elegans，reveals a novel，azetidine－containing indole alkaloids［J］.Org Lett，2005，5(12):2075－2078.

［4］謝 立，韓雪峰.鉤吻中毒的機(jī)制、臨床特點(diǎn)及處理［J］.藥物不良反應(yīng)雜志，2006，8(3):202－204.

［5］Kitajima M，Nakamura T，Kogure N，et al.Isolation of gelsedinetype indole alkaloids from gelsemium elegans and evaluation of the cytotoxic activity of gelsemium alkaloids for A431 epidermoid carcinoma cells［J］.J Nat Prod，2006，69(4):715－718.

［6］吳達(dá)榮，蔡 晶，遲德彪.鉤吻素子抗腫瘤作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2006，22(5):6－8.

［7］張?zhí)m蘭，王志睿，黃昌全，等.鉤吻總生物堿中鉤吻素子的提取與分離［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24(9):1006－1008.

［8］陳志慧，周家容.不同提取方法對斷腸草總生物堿提取率的影響［J］.農(nóng)藥，2007，46(3):176－181.

［9］陳志慧，宋光泉，周家容.酸性染料比色法測定斷腸草總生物堿的含量［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28(3):440－443.

［10］張?zhí)m蘭，黃昌全，張忠義，等.均勻設(shè)計(jì)與正交設(shè)計(jì)在鉤吻生物總堿提取工藝篩選研究中的應(yīng)用［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23(9):914－915.