王瑞芬， 郭海麗

(1.濮陽市食品藥品檢驗(yàn)所，河南濮陽 457000;2.河南華峰制藥有限公司，河南濮陽 457000)

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀:515型高壓泵;2487紫外檢測(cè)器;N2000工作站。Precisa 92SM-202A電子分析天平，感量0.01 mg(普利賽因國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司)，KQ 2200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品，批號(hào)分別為:110795-200806、0757-200206、 110756-200110、 110796-200513、110758-200509，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;喘舒片批號(hào)為:20091202，20091203，20091204 河南華峰制藥有限公司;甲醇為進(jìn)口色譜純(美國(guó));水為重蒸水;其它試劑均為分析純。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Lanbo? Kromasil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.3% 磷酸(80:20);檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20 μL;理論塔板數(shù)按蘆薈大黃素峰計(jì)均不低于7 000;分離度大于1.5。按以上色譜條件得到對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液色譜圖，見圖1。

圖1 喘舒片HPLC色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液與供試品溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備:分別精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，置50 mL量瓶中，加甲醇制成含蘆薈大黃素46.8 μg/mL、大黃酸 49.0 μg/mL、大黃素 53.0 μg/mL、大黃酚116 μg/mL、大黃素甲醚73.8 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，備用。

供試品溶液的制備:取供試品20片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置燒瓶中，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL、鹽酸2 mL和三氯甲烷20 mL，加熱回流1 h，立即冷卻，分取三氯甲烷層，水層再用三氯甲烷振搖提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定法:分別精密吸取對(duì)照品和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品混合液1、2、3、4、5 mL 置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取各濃度對(duì)照品混合液20 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:蘆薈大黃素在進(jìn)樣量0.093 6 μg～0.468 μg、大黃酸在進(jìn)樣量 0.098 μg ～ 0.49 μg、大黃素在進(jìn)樣量0.106 μg ～0.53 μg、大黃酚在進(jìn)樣量0.232 μg ～1.16 μg、大黃素甲醚在進(jìn)樣量0.147 6 μg～0.738 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4 陰性對(duì)照試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取按處方比例除去大黃粉的其它藥材適量，依照喘舒片的制備工藝和供試品溶液的制備方法制得缺大黃粉的空白對(duì)照溶液，作為陰性對(duì)照液。按上述色譜條件測(cè)定，供試品色譜中5種待測(cè)成分色譜峰保留時(shí)間與相應(yīng)對(duì)照品峰的保留時(shí)間一致，陰性對(duì)照色譜圖上在此保留時(shí)間無干擾。見圖1。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液20 μL(批號(hào)為:20091204)，按上述色譜條件，平行進(jìn)樣5次，根據(jù)峰面積，測(cè)得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的 RSD分別為0.63%、0.62%、1.02%、0.82% 、1.14% 。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣 20 μL，測(cè)定峰面積，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積RSD分別為 0.96%、1.04%、1.12%、1.06%、0.92%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品5份，按供試品溶液制備方法制得供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，分析測(cè)定，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.04%、1.34%、1.09%、1.32%、1.15%，表明重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批號(hào)樣品(批號(hào):20091204)約2.0 g，精確加入一定量對(duì)照品，按供試品制備項(xiàng)下方法操作，測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1～5。

表1 蘆薈大黃素加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 大黃酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測(cè)定 取樣品3批，按供試品制備項(xiàng)下方法制得供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，分別代入回歸方程，計(jì)算樣品中各組分含量，結(jié)果見表6。

表3 大黃素加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 大黃酚加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 大黃素甲醚加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 5種蒽醌類成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)報(bào)道的蒽醌類成分含量測(cè)定方法，經(jīng)大量試驗(yàn)最終確定流動(dòng)相為甲醇-0.3%磷酸(85:15)［9-10］，樣品中5種待測(cè)成分分離良好。

在試驗(yàn)過程中，對(duì)樣品的前處理，曾先后采用超聲處理15 min、30 min、45 min 與加熱回流 30 min、1 h、2 h兩種方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超聲處理30 min，樣品中各待測(cè)成分已基本溶出?；亓魈崛? h和超聲提取30 min均可達(dá)滿意結(jié)果，考慮到超聲提取操作簡(jiǎn)便，時(shí)間易于控制等優(yōu)點(diǎn)，最終選定該方法為宜。

［1］王 猛，孫忠親，宮瑞萍.HPLC測(cè)定喘舒片中鹽酸克侖特羅含量［J］. 中成藥，2003，25(4):85-86.

［2］王家和，郭桂秋，李俊田，等.PHLC法測(cè)定喘舒片中黃芩苷的含量［J］. 中國(guó)藥業(yè)，2003，12(1):43-44.

［3］潘成學(xué)，姬生國(guó)，申小靜.高效液相色譜法測(cè)定喘舒片中黃芩苷的含量［J］.河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20(3):34-35.

［4］岳淑梅，馮玲玲，齊瀟瀟，等.肝寧顆粒中大黃所含5中蒽醌苷元的 HPLC 測(cè)定［J］.中成藥，2008，30(8):1155-1158.

［5］汪 霞.反相HPLC法測(cè)定黃連上清片中大黃酸、大黃素、大黃酚的含量［J］. 藥物分析雜志，2008，28(8):1310-1312.

［6］徐韌柳，劉會(huì)英.RP-HPLC測(cè)定珍黃散中大黃素和大黃酚的含量［J］. 中成藥，2004，26(2):108-110.

［7］張 丹，蔣心惠.反相高效液相色譜法測(cè)定大黃藥材中游離及結(jié)合型蒽醌類衍生物的含量［J］.分析化學(xué)，2003，31(4):459-462.

［8］張 村，李 麗，肖永慶，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定大黃不同來源藥材中2個(gè)蒽醌苷類成分的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30(1):53-55.

［9］馬志剛，曹秋娥，丁中濤，等.反相高效液相色譜測(cè)定大黃及其制劑中蒽醌類成分［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2006，28(S1):255-258.

［10］王燕萍，武新安.HPLC測(cè)定燒燙傷凝膠中蒽醌類成分的含量［J］.中成藥，2006，28(8):1120-1122.