劉俊紅， 方步武， 伍孝先， 李棣華， 吳咸中

(1.天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所，天津 300100;2.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070)

大承氣顆粒與《傷寒論》中大承氣湯的處方組成相同(大黃、厚樸、枳實(shí)、芒硝)，作為醫(yī)院制劑在天津市南開(kāi)醫(yī)院用于急腹癥的中西醫(yī)結(jié)合治療已20余年。目前我院采用先進(jìn)工藝提取精制的大承氣顆粒，用于腸梗阻［1］、急性胰腺炎［2］、內(nèi)毒素血癥［3］及其它腹腔感染性疾?。?］的治療，取得滿意療效。有文獻(xiàn)報(bào)道大黃酚在兔體內(nèi)血藥濃度的測(cè)定［5-6］，金氏痔瘡膏或通脈活血靈膠囊制劑中大黃酚的HPLC測(cè)定［7-8］，但大承氣復(fù)方中大黃有效成分的血藥濃度測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道。本研究的系列工作表明，大承氣顆粒給大鼠灌胃后，大黃的主要成分可被吸收入血［9］，其血清中大黃酚的測(cè)定不受方中其它成分和空白血清的干擾，從而建立了測(cè)定大承氣顆粒中大黃酚的血藥濃度的HPLC，并初步分析了其血藥濃度的變化，為大承氣顆粒的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 動(dòng)物

Wistar大鼠10只，清潔級(jí)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院第四研究所動(dòng)物室提供，體重200 g～250 g，♀♂兼用。

1.2 儀器

日本島津LC-10ATvp高效液相色譜儀;SPD-10Avp紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器;數(shù)據(jù)處理使用SSI分析之星工作站;日本島津Libror AEG-120萬(wàn)分之一天平;LXJ-64-01型離心機(jī)(北京醫(yī)療儀器修理廠)。

1.3 藥品與試劑

大承氣顆粒(天津市南開(kāi)醫(yī)院藥物研究室制備);大黃酚對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)0796-9404);乙腈、甲醇均為色譜純，氯仿、高氯酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 大鼠用藥劑量和藥物血清制備

大承氣顆粒單次用藥劑量為1.205 g/kg，配成濃度為0.2 g/mL的混懸液，用前充分搖勻;大鼠灌胃 0.602 5 mL/100 g，分別于灌胃后30 min、45 min、1、1.5、3、6、12、24 h 大鼠球后靜脈叢采血，各時(shí)間點(diǎn)采血均約 1 mL，離心 3 500 r/min，20 min，血清分裝，－20℃凍存。

2.2 血清樣品的處理

分別將不同時(shí)間段的血清解凍，精密吸取500 μL置于10 mL離心管中，精密加入1 mL高氯酸，振搖1 min，再精密加入氯仿提取2次，每次5 mL，振搖 1 min，離心(4 000 r/min，20 min)，吸取氯仿層合并，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，冷風(fēng)吹干，殘留物用甲醇100 μL溶解作為樣品液。

2.3 色譜條件

色譜柱kromasil C18250 mm×4.6 mm，流動(dòng)相:甲醇-水(含1%高氯酸)80∶20，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，靈敏度 0.01 AUFS，進(jìn)樣20 μL，室溫。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取約10 mg大黃酚對(duì)照品，精密稱定，加入50 mL量瓶中用乙腈稀釋至刻度，作為貯備液。從中精密吸取0.1、0.2、0.6、0.8、1.0 mL 加入 5 mL 量瓶，用乙腈稀釋至刻度，再?gòu)臐舛茸畹鸵环輼?biāo)準(zhǔn)溶液中精密吸取2.5 mL用乙腈溶解于10 mL量瓶中。進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，繪制AU-C曲線圖，線性方程為Y=1.060×10－5X+3.027 ×10－1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。

2.5 校正曲線的制備

從上述標(biāo)準(zhǔn)溶液中的五個(gè)濃度，分別精密吸取100 μL置于10 mL離心管中，冷風(fēng)吹干，加入500 μL空白血清，按2.3項(xiàng)下操作，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，繪制AU-C曲線圖，線性方程為Y=1.050×10－5X+2.034 ×10－1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，線性范圍為0.855 μg/mL。按上述色譜條件測(cè)定血清中大黃酚最低檢測(cè)濃度為0.855 μg/mL。

2.6 回收率及精密度試驗(yàn)

分別取高、中、低三個(gè)濃度的大黃酚標(biāo)準(zhǔn)液，各精密吸取100 μL，加入到10 mL具塞離心管中，冷風(fēng)吹干，加入500 μL空白血清溶解，再按2.2項(xiàng)下處理后進(jìn)樣測(cè)定，與相應(yīng)對(duì)照品峰面積比較計(jì)算回收率。并且于日內(nèi)不同時(shí)間和不同的日間分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差和日間標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率及精密度試驗(yàn)

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

分別取大鼠灌胃1 h、6 h后的血清，各5份，再按2.2項(xiàng)下“精密吸取500 μL……作為樣品液”處理后進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣20 L。結(jié)果血清樣品中大黃酚RSD值分別為6.66%、7.18%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密吸取濃度為1.14 μg/mL和27.36 μg/mL的大黃酚標(biāo)準(zhǔn)液100 μL，分別加入到10 mL具塞離心管中，冷風(fēng)吹干，加入500 μL空白血清溶解，再按2.2項(xiàng)下“精密加入1 mL高氯酸……作為樣品液”處理，分別于 0、4、8、24、48 h 進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣20 L。結(jié)果血清樣品中大黃酚在48 h內(nèi)RSD值分別為5.53%、2.28%，穩(wěn)定性良好。

2.9 結(jié)果

2.9.1 大承氣顆粒中大黃酚的含量測(cè)定 按照?qǐng)?bào)道的方法［10］制備大承氣顆粒并測(cè)定其中的大黃酚含量為5.98 mg/g。

2.9.2 空白血清色譜行為 取空白血清500 μL，按2.2項(xiàng)下操作。進(jìn)樣檢測(cè)，血清中雜質(zhì)不干擾大黃酚的含量測(cè)定。

2.9.3 大黃酚血藥濃度測(cè)定及血藥濃度—時(shí)間曲線圖 將按2.2項(xiàng)法處理過(guò)的不同時(shí)間段血清樣品進(jìn)樣20 μL，用外標(biāo)法測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1-A。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3只大鼠，取其平均值，以橫坐標(biāo)為不同取血時(shí)間，縱坐標(biāo)為大黃酚的濃度，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線，見(jiàn)圖2。由圖中可以看出，在灌胃1h后大黃酚的含量達(dá)到峰值，出現(xiàn)兩個(gè)吸收峰值。

圖1 含藥血清、空白血清和標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖

圖2 大黃酚血藥濃度—時(shí)間曲線

3 討論

3.1 檢測(cè)指標(biāo)的確定

本提取方法能分離出大承氣顆粒中大黃四種蒽醌類成分，見(jiàn)圖1-A、1-C。但用缺項(xiàng)大黃的復(fù)方作為陰性對(duì)照藥給大鼠灌胃，1 h后采血，經(jīng)同法提取測(cè)定，色譜圖中對(duì)應(yīng)于蘆薈大黃素、大黃酸處有干擾峰，與復(fù)方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定結(jié)果相似;大黃素體內(nèi)含量較低，而且空白血漿對(duì)其略有干擾;大黃素甲醚微量，忽略不計(jì)，因此，選用大黃酚作為指標(biāo)測(cè)定。

3.2 溫度對(duì)檢測(cè)的影響

溫度對(duì)出峰時(shí)間影響很大，本研究控制室溫24℃時(shí)，大黃酚出峰時(shí)間為24.5 min。

3.3 水解用酸與提取劑的選擇

根據(jù)我們以往經(jīng)驗(yàn)與文獻(xiàn)報(bào)道［11-12］，分別考察了鹽酸、硫酸、高氯酸;乙醚-環(huán)己烷、乙醚、氯仿，最后確定用高氯酸水解，氯仿提取2次，大黃酚的測(cè)定不受血清干擾，且回收率較好。

3.4 我們?cè)么簏S生藥、單味大黃提取物給大鼠灌胃，1 h后采血，經(jīng)同法提取測(cè)定，結(jié)果大黃生藥體內(nèi)血藥濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大黃提取物，說(shuō)明大黃提取物更利于體內(nèi)吸收。

3.5 測(cè)定復(fù)方制劑血藥濃度的意義

中藥復(fù)方由若干味中藥組成，每味中藥又含有多種成分，多數(shù)中藥或復(fù)方現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中“指標(biāo)性成分”多為主要藥物的主要成分或可檢測(cè)成分，并無(wú)充分依據(jù)證明其為有效成分。由于藥物在吸收等環(huán)節(jié)的相互作用，只有被吸收入血的成分才具有成為有效成分的可能。本研究證實(shí)復(fù)方中大黃的幾個(gè)蒽醌類主要成分被吸收入血，以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚的血藥濃度較高，所建立的方法適用于血中大黃酚的定量測(cè)定，復(fù)方灌胃后約1 h，血中大黃酚的濃度達(dá)到峰值。大承氣顆粒有一重要的作用環(huán)節(jié)即縮小腸道細(xì)菌庫(kù)及內(nèi)毒素池和保護(hù)腸屏障，雖然目前沒(méi)有報(bào)道大黃酚在這方面的藥理作用，但本研究對(duì)確定其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有一定的意義。

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