聶 瓊，劉仁祥

（貴州大學(xué)煙草科學(xué)研究中心，貴陽 550025）

分子標記為研究作物遺傳多樣性及其品種改良提供了新的手段。在作物分子標記及其應(yīng)用研究中，目前主要有RFLP、RAPD、SSR、SRAP、ISSR和AFLP標記等，這些都有效提高了作物遺傳分析的效率和準確性。SSR是指由幾個（多為2～4個）堿基組成的串聯(lián)重復(fù)的 DNA序列，如(CA)n，(ATG)n， (TAGG)n等重復(fù)。其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性導(dǎo)致了SSR長度的高度變異性。由于其操作簡單、多態(tài)含量豐富、遺傳信息量大、共顯性及檢測方便等特點，被認為是一種理想的遺傳標記，已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和分子標記輔助育種等研究領(lǐng)域。目前，在水稻、玉米、番茄、小麥、擬南芥、辣椒等植物中應(yīng)用較多。煙草是一種重要的經(jīng)濟作物，也在科學(xué)研究中廣泛應(yīng)用，但是SSR標記在煙草上的應(yīng)用，國內(nèi)外報道較少。這是因為SSR標記技術(shù)應(yīng)用的前提是特異物種的SSR引物的設(shè)計開發(fā)，其開發(fā)有一定難度，費用也較高，因此限制了SSR標記在煙草遺傳分析上的發(fā)展。針對煙草的SSR標記引物開發(fā)工作，直到2007年初，Bindler等進行了首次報道[1]，目前國內(nèi)此類報道還較少。

本研究將同科植物的SSR引物應(yīng)用于煙草，同時對其在煙草品種資源中的應(yīng)用進行探討，這對于加速煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究利用、豐富其分子標記類型與繪制遺傳圖譜具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

用于篩選引物的煙草材料14份（表1），包括烤煙、雪茄煙、白肋煙、曬晾煙、香料煙和野生種。用于遺傳多樣性分析的烤煙品種（系）24份（表2）。

表1 供試材料Table1 The test materials

1.2 方法

1.2.1 煙草基因組 DNA 提取 采用 CTAB 高鹽沉淀法[2]。

1.2.2 SSR標記分析 擴增反應(yīng)在 Eppendorf-PC5331型PCR儀上進行，采用10 μL體系進行擴增，其中含10 ng模板DNA，2×Taq PCR MasterMix 5 μL（北京 TIANGEN），引物濃度為 0.5 μmol/L。擴增程序為：預(yù)變性94 ℃ 4 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s（退火溫度根據(jù)引物調(diào)整），72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最終72 ℃ 延伸7 min。SSR引物序列（表3）選自文獻[3-4]，由上海生物工程有限公司合成。擴增產(chǎn)物經(jīng)10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 SSR 擴增帶形以0和1統(tǒng)計，建立數(shù)據(jù)庫。在相同遷移率位置上，有帶記為 1，無帶記為0。計算引物多態(tài)信息量（PIC），PIC= 1-ΣPi2，Pi表示第i個等位位點出現(xiàn)的頻率。按Nei等（1979）的方法[5]計算任意兩個品種的相似系數(shù)（GS）：GS=2Nij(Ni+Nj)，其中，Ni和 Nj分別為 i和j兩份材料總的等位基因數(shù)，Nij為i和j兩材料的共有等位基因數(shù)，遺傳相異系數(shù)（GD）=1-GS，利用DPS 軟件，采用GD值按不加權(quán)成對群算數(shù)平均法（UPGMA）進行聚類分析，構(gòu)建分子進化系統(tǒng)樹狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 引物篩選

選取 5個類型 14個遺傳差異大的煙草材料DNA為模板，從22對SSR引物中篩選到多態(tài)性、重復(fù)性、穩(wěn)定性都較好的8對引物，引物多態(tài)性見表4。其中9號引物的電泳譜帶清晰可見，且不同品種的條帶不同，多態(tài)性為 100%（圖1）。8對引物共檢測到72條譜帶，60條遺傳多態(tài)性帶，多態(tài)性條帶數(shù)比率達83.33%，擴增片斷長度為80～500 bp，每對引物擴增的多態(tài)性帶數(shù)目為4～14個，平均7.5條；引物多態(tài)信息量變化范圍為0.714～1，平均 0.811。這表明，這些引物在檢測煙草基因組遺傳多態(tài)性上有較顯著的檢出效率，可以用于煙草SSR圖譜的檢測，并可進行煙草遺傳多樣性分析和指紋圖譜的構(gòu)建。

表2 供試材料編號、 名稱及來源Table2 Code, name and origins of tobacco germplasms

表3 SSR 引物編號、序列及來源Table3 SSR primers’ codes, sequences and origins

2.2 SSR引物對烤煙品種（系）遺傳多態(tài)性分析

應(yīng)用篩選出的8對引物對24份烤煙品種（系）進行SSR擴增，8對引物共檢測到98個位點，其中 66個具有遺傳多態(tài)性，每對引物擴增的多態(tài)性帶數(shù)目為5～16個，平均8.2個，引物多態(tài)信息量變化范圍為 0.451～1，平均 0.646。擴增片斷長度為50～560 bp。24個煙草材料的DNA譜帶表現(xiàn)出較好的遺傳多態(tài)性，圖2是引物9對24個烤煙材料的SSR圖譜，譜帶可把24個品種完全區(qū)分開，表現(xiàn)出100%的多態(tài)性。

表4 多態(tài)性引物Table4 The primers which produced polymorphic bands

圖1 14個煙草材料DNA-SSR 指紋圖譜。1-14：引物9的擴增圖譜；16-29：引物14的擴增圖譜；M：MarkerFig.1 Result of PCR amplification using primers 9 and 14

圖2 引物9 對24 份煙草材料的SSR 擴增圖譜。M：Marker，1～24為材料編號，其對應(yīng)的品種名稱同表2Fig.2 SSR patterns of 24 tobacco amplified by primer 9

2.3 品種（系）間親緣關(guān)系和聚類分析

根據(jù)8對引物的SSR圖譜，建立0-1數(shù)據(jù)庫，計算24個供試材料樣本間的遺傳相異系數(shù)（GD）。結(jié)果表明，遺傳相異系數(shù)變異范圍為 0.3445～0.8626，平均 0.6052，其中紅花大金元和威寧白花煙的遺傳相異系數(shù)最小，僅為0.3445，表明兩者的親緣關(guān)系最近。NC82和韭菜坪2號之間的遺傳相異系數(shù)最大（0.8626），表明它們相互之間的遺傳基礎(chǔ)相對較遠。整體來看，引進品種的遺傳相異系數(shù)0.6057略低于貴州選育品種（系）0.6236，表明我省地方材料品種的遺傳差異較大。本中心自選品系GDH系列的遺傳相異系數(shù)較近，為0.5640。在所有供試材料中，Va116與其他品種的遺傳相異系數(shù)最高，遺傳相異系數(shù)在0.484～0.717之間，說明此品種與其他供試材料間遺傳基礎(chǔ)相對較大，遺傳相似性最低。

利用SSR遺傳距離矩陣按UPGMA方法構(gòu)建了各個供試品種的樹狀聚類圖（圖3）。聚類結(jié)果與品種間的親緣關(guān)系具有較好的一致性：在遺傳距離為0.63水平時，可將24個品種聚為4個類群，大部分美國引進品種和本中心自育的品系都在第Ⅰ類；Coker147和Va116獨自成第Ⅱ和第Ⅳ類；貴州自育或地方品種及云煙 317，NC27NF等部分引進品種歸為第Ⅲ類。在遺傳距離為0.54水平時，第Ⅰ類又可分為3個亞類，第Ⅰ亞類包括G70、GDH黃葉突變體、RG11、G80、C1-5-1、GDH84、GDH64，其中本中心自育的品系GDH84、GDH64、GDH黃葉突變體和G70、G80都有G28的血統(tǒng)，因此聚為一類。NC82自成第Ⅱ亞類，第Ⅲ亞類包括GDH02、K326、8611、GDH279、水城煙、K730，其中 GDH02、GDH279都具有8611的血統(tǒng)，而8611是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所用（單育2號×G-28）×（G-28×凈葉黃）雜交育成的，也是G28的后代。第Ⅲ類又分為4個亞類。GDH88，NC27NF各自成為第Ⅰ亞類和第Ⅳ亞類，第Ⅱ亞類包括紅花大金元、威寧白花煙、南江3號、G140，其中南江3號是從紅花大金元品種中獲得的自然變異株，經(jīng)系統(tǒng)選擇培育而成。第Ⅲ亞類包括韭菜坪2號和云煙317。系譜分析表明，多數(shù)品種的親緣關(guān)系與聚類結(jié)果基本一致，少數(shù)不一致，這可能與其長期定向栽培選育過程中產(chǎn)生變異有關(guān)。

3 討 論

圖3 24 份煙草材料基于SSR 標記的聚類圖Fig.3 Clustering of 24 tobacco materials based on SSR

一些研究人員早已證明一個物種的微衛(wèi)星引物可以在研究其近源植物中被利用[5-6]。筆者運用番茄、辣椒的SSR引物對24份在煙草育種中貢獻較大的種質(zhì)進行SSR擴增分析，結(jié)果表明遺傳相異系數(shù)變異范圍在0.3445～0.8626之間，平均0.6052，說明這些品種（系）之間的遺傳背景較遠。聚類分析結(jié)果也從分子水平進一步驗證了我國煙草育種資源的匱乏，主要使用的主體親本是 K326、紅花大金元和 G28。梁景霞[8]、肖炳光[9]、陶愛芬等[10]分別運用ISSR、RAPD、AFLP、SRAP、SSR等標記對現(xiàn)有主要育成品種和栽培煙草品種的遺傳多樣性及系譜親緣關(guān)系進行了分析，發(fā)現(xiàn)品種之間的遺傳背景相似，親緣關(guān)系較近，特別是烤煙品種之間存在著遺傳基礎(chǔ)狹窄的問題。與前人的研究結(jié)果相比，筆者發(fā)現(xiàn)本研究的這些烤煙品種（系）間的親緣關(guān)系較遠，這與這些材料是本中心雜交育種中貢獻較大有關(guān)，作為雜交育種親本，差異一般都較大。

研究還表明我省選育品種和地方材料的遺傳差異大于引進品種。貴州省屬山區(qū)氣候特點，生態(tài)環(huán)境差異比較大，栽培選育的煙草品種之間的差異也較大，這有利于我省煙草品種資源的利用與發(fā)展。筆者認為結(jié)合煙區(qū)生態(tài)條件，充分發(fā)揮貴州煙葉生產(chǎn)地區(qū)生態(tài)環(huán)境差異大的優(yōu)勢，加強對現(xiàn)有特色品種的改良，在突出地方特色品種風(fēng)格的基礎(chǔ)上，提高綜合性狀，可培育一批具有鮮明地方特色的新品種。

4 結(jié) 論

本實驗的結(jié)果與實際材料的親緣關(guān)系基本一致，并揭示了不同品種的遺傳基礎(chǔ)，表明同科植物的SSR引物可對煙草種質(zhì)資源進行遺傳差異分析，而且也可為煙草品種的鑒定、遺傳分析和核心種質(zhì)的構(gòu)建提供可靠信息，有著潛在的應(yīng)用價值。

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