徐 軍，劉艷華，任 民，牟建民，張興偉，陳雅瓊，王志德*

（1.農(nóng)業(yè)部煙草類作物質(zhì)量控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

煙草在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位，煙草種質(zhì)真實(shí)性和純度直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量，因此，種質(zhì)鑒定是煙草生產(chǎn)和研究工作中的重要一環(huán)。傳統(tǒng)的鑒定方法主要有形態(tài)鑒定、蛋白及同工酶鑒定[1]，但這些方法易受實(shí)驗(yàn)材料所處發(fā)育時(shí)期、取樣部位和環(huán)境等多種因素的影響，準(zhǔn)確率不高，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜，操作程序繁瑣，難以大規(guī)模推廣應(yīng)用。近年來(lái)發(fā)展的分子標(biāo)記技術(shù)克服了傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，被越來(lái)越多地應(yīng)用到種質(zhì)鑒定工作中，分子標(biāo)記技術(shù)種類較多，常用的有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，其中SSR標(biāo)記具有結(jié)果可靠，重復(fù)性好，多態(tài)性豐富，操作簡(jiǎn)單，呈共顯性遺傳等特點(diǎn)[2-3]，已被應(yīng)用于水稻[4]、玉米[5]、櫻桃[6]等多種作物的種質(zhì)鑒定中。

本研究利用SSR標(biāo)記技術(shù)，從分子水平上鑒別區(qū)分了80份普通煙草種質(zhì)，并構(gòu)建了它們的SSR指紋圖譜，驗(yàn)證了用SSR標(biāo)記鑒別煙草種質(zhì)的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究選取煙草核心種質(zhì)中的 80份普通煙草種質(zhì)為材料，包括14份白肋煙，9份香料煙，6份雪茄煙，26份烤煙，25份曬煙。材料均由國(guó)家煙草種質(zhì)庫(kù)提供。

1.2 DNA提取

供試材料溫室育苗，長(zhǎng)成幼苗后用CTAB法提取基因組總DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)含量后保存于-20 ℃冰箱待用。

1.3 SSR檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)所用286對(duì)SSR引物序列為Bindler等[7]人公布，下載自http://solgenomics.net。PCR擴(kuò)增總體 15 μL，其中包括 1×PCR 緩沖液，MgCl21 mmol/L，dNTPs各1.2 mmol/ L , Taq酶1 U，引物0.4 μmol/L ,基因組 DNA 20 ng ，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min 后，94 ℃ 變性 45 s ，58 ℃ 退火 45 s ，72 ℃ 延伸45 s ，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃再次延伸10 min，最后4 ℃保存。其中退火溫度要根據(jù)引物的不同而調(diào)整。

1.4 電泳及染色

PCR產(chǎn)物用 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，以1×TBE作緩沖液，180 V恒壓進(jìn)行電泳。電泳后，銀染，拍照。銀染方法如下：

卸板后漂洗；然后在染色液（1 L水中溶解2 g硝酸銀，5 mL冰乙酸，100 mL無(wú)水乙醇）中染色10 min；再次漂洗后放入顯色液（1 L水中溶解15 g氫氧化鈉，3 mL 37 %甲醛）中顯色。

2 結(jié) 果

2.1 SSR多態(tài)性分析

通過(guò)對(duì)286對(duì)SSR特異性引物進(jìn)行篩選，從中選出8對(duì)反應(yīng)穩(wěn)定，擴(kuò)增條帶清晰，多態(tài)性強(qiáng)的引物，對(duì)這80份材料DNA進(jìn)行擴(kuò)增（圖1），共得到85個(gè)等位位點(diǎn)，其中引物 PT20189、PT20287、PT30380、PT30403的等位位點(diǎn)數(shù)最少，為9個(gè)；引物 PT20372、PT20213的等位位點(diǎn)最多，為 14個(gè)，平均為10.6個(gè)（圖2）。通過(guò)POPGENE軟件分析可知8個(gè)引物等位位點(diǎn)多態(tài)性信息含量 ( P I C)變幅為0.63～0.88，平均為0.81（表1）。

2.2 SSR指紋圖譜構(gòu)建

以“1”和“0”分別表示擴(kuò)增產(chǎn)物的“有”和“無(wú)”，將 8對(duì)SSR引物產(chǎn)生的 85 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)依次排序，形成一個(gè) SSR數(shù)據(jù)矩陣（表2），建立品種計(jì)算機(jī)化的 DNA 指紋，以區(qū)分供試的每個(gè)品種。對(duì)SSR數(shù)據(jù)矩陣聚類分析，發(fā)現(xiàn)這8對(duì)引物可完全將這80份煙草種質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái)（圖3），每一份種質(zhì)都有自己獨(dú)特的指紋圖譜（圖4）。

圖1 引物PT30380對(duì)部分材料擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplified result of part of materials by primer PT30380

圖2 引物PT20202擴(kuò)增的多態(tài)性條帶Fig.2 The polymorphic bands amplified by primer PT20202

表1 8對(duì)SSR引物名稱, PIC值, 檢測(cè)到的等位位點(diǎn)數(shù)目Table 1 The name of 8 pairs of SSR primer, PIC of primers and the number of the variance allele

表2 部分材料對(duì)引物PT20189和PT20287的擴(kuò)增結(jié)果Table 2 The PCR results of some materials by primer PT20189 and PT20287

圖3 80份煙草種質(zhì)基于SSR分析的UPGMA聚類圖Fig.3 Dendrogram derived from UPGMA cluster analysis based on SSR analysis method among 80 tobacco germplasms

圖4 485號(hào)材料對(duì)8對(duì)引物擴(kuò)增的指紋圖譜Fig.4 The DNA fingerprint of material NO.485 amplified by 8 primers

3 討 論

目前用分子標(biāo)記鑒定煙草種質(zhì)的研究還較少，RAPD技術(shù)有過(guò)報(bào)道[8-10]，但RAPD標(biāo)記的重復(fù)性和穩(wěn)定性一直存在爭(zhēng)議，需要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件才能得到理想結(jié)果[9]，且擴(kuò)增位點(diǎn)多態(tài)性不如SSR 標(biāo)記豐富。如Coussirat J C[11]用160 對(duì)引物對(duì)32份煙草種質(zhì)進(jìn)行了RAPD分析，其中9對(duì)引物擴(kuò)增出了29個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每對(duì)引物3.2個(gè)。許明輝等[9]利用235對(duì)引物對(duì)23份煙草種質(zhì)進(jìn)行RAPD分析，其中16對(duì)引物擴(kuò)增出46個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每個(gè)引物2.9個(gè)。SSR引物在煙草上的發(fā)展和其他作物相比較晚，直到 2007年，Bindler等[7]首次報(bào)道了煙草的微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳圖譜，因此，SSR在煙草研究上應(yīng)用還不廣泛。本實(shí)驗(yàn)中，從286對(duì)SSR引物中篩選的8對(duì)引物共擴(kuò)增出85個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每對(duì)引物10.6個(gè)，多態(tài)性明顯優(yōu)于RAPD引物，這與劉冠明等[12]的研究結(jié)果一致。這幾對(duì)引物的重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果也表明 SSR標(biāo)記的重復(fù)性和穩(wěn)定性很好。此外，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記對(duì)反應(yīng)條件要求不嚴(yán)格，如反應(yīng)對(duì)DNA模板質(zhì)量要求不高，略微改變反應(yīng)體系不會(huì)對(duì) PCR反應(yīng)結(jié)果造成明顯影響，與朱英等[13]的報(bào)道也相符合。因此，與RAPD標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記更適合于普通煙草種質(zhì)鑒定和指紋圖譜構(gòu)建工作，SSR標(biāo)記將會(huì)在煙草種質(zhì)鑒定工作中發(fā)揮更加重要的作用。

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