王小平，劉 峰，韓 翠，馬存德

(1．陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046;2．陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，陜西 咸陽(yáng) 712000)

中藥復(fù)方制劑在提取過(guò)程中，由于各藥味的化學(xué)成分相互影響，產(chǎn)生助溶、化學(xué)反應(yīng)等現(xiàn)象，使中藥復(fù)方制劑中提取的有效成分發(fā)生變化，直接影響中藥復(fù)方制劑的臨床療效。因此，研究中藥復(fù)方制劑有效成分的變化是中藥復(fù)方研究的一個(gè)重要內(nèi)容[1]。丹紅注射液 (國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026866)具有活血化瘀、通脈舒絡(luò)功能，用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風(fēng)、冠心病、心絞痛，心肌梗塞等癥。復(fù)方配伍由于藥物間的相互作用使得化學(xué)成分更加復(fù)雜多變，用某一種或幾種化學(xué)成分的含量難以全面評(píng)價(jià)復(fù)方的制備工藝，而指紋圖譜在中藥或中成藥的研究和應(yīng)用越來(lái)越廣泛[2－4]。因此，筆者采用指紋圖譜技術(shù)，分析、比較丹參和紅花分提和合提兩種提取液，探討兩藥不同提取方法所得提取液化學(xué)組成成分的差異。旨在為丹紅注射液的工藝改進(jìn)提供理論依據(jù)。

1 儀器、試藥與材料

1.1 儀器與材料

戴安UitiMate 3000全自動(dòng)高效液相色譜儀，泵:UitiMate 3000;自動(dòng)進(jìn)樣器:UitiMate 3000;檢測(cè)器:UitiMate 3000UV檢測(cè)器。工作站:Chromeleon。UV756紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (上海精密科學(xué)儀器有限公司)。Discovery DV215CD型雙量程電子分析天平 (瑞士;0.01mg;0.1mg)

1.2 試藥

羥基紅花黃色素A(111637－200503)、丹參素鈉對(duì)照品 (110855－200405)、丹酚酸B對(duì)照品(111562－200807)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。原兒茶醛均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部中藥現(xiàn)代化研究中心提供。流動(dòng)相所用甲醇、乙腈為色譜醇，其他試劑如:磷酸等均為分析純;丹參、紅花來(lái)自山東菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:迪馬公司Diamonsil(鉆石)C18色譜柱 (4.6mm×250mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇－乙腈－0.4%的磷酸水，梯度洗脫;流速:1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):377 nm，柱溫:25℃;進(jìn)樣量:15μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取羥基紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、原兒茶醛對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋，制成每1mL溶液含羥基紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、原兒茶醛分別為0.2mg．

表1 梯度變化表

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 丹參和紅花合提

取丹參藥材飲片3份:紅花藥材1份(為丹紅注射液處方組成的比例)，兩藥合并，加水10倍量，提取3次，每次0.5h，過(guò)濾，合并濾液，備用。

2.3.2 丹參、紅花分別提取

取與“2.3.1”項(xiàng)下相同量的藥材，分別加水10倍量，提取3次，每次0.5h，過(guò)濾，濾液合并，備用。

2.4 精密度試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，用MATLAB軟件計(jì)算相似度，在同一儀器測(cè)得的色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度分別為0.9925，0.9956，0.9943，0.9928，0.9964，滿足相似度不小于0.950，并考察色譜峰保留時(shí)間和峰面積的一致性，羥基紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、原兒茶醛保留時(shí)間RSD和峰面積的RSD均小于1.9%．

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別于0，1.5，3，6，8，12 h進(jìn)樣檢測(cè)，直觀觀察指紋圖譜的全貌無(wú)明顯變化，用MATLAB軟件計(jì)算相似度，在同一儀器測(cè)得的色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度分別為0.9971，0.9948，0.9906，0.9925，0.9916，滿足相似度不小于0.950，并考察保留時(shí)間和峰面積的一致性，羥基紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、原兒茶醛保留時(shí)間RSD和峰面積的RSD均小于1.8%，表明在此時(shí)間內(nèi)供試品溶液中的上述成分是穩(wěn)定的。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取同一丹參藥材飲片、紅花藥材樣品6份，制備供試品溶液，分別注入液相色譜儀測(cè)定，所得色譜指紋圖譜直觀觀察，表明指紋圖譜的全貌無(wú)明顯變化，用MATLAB軟件計(jì)算相似度，在同一儀器測(cè)得的色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的 相 似 度 分 別 為 0.9927，0.9935，0.9956，0.9918，0.9938，0.9959，均大于0.95，并考察保留時(shí)間和峰面積的一致性，羥基紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、原兒茶醛保留時(shí)間RSD和峰面積的RSD均小于1.9%．

2.7 樣品測(cè)定

分別精密吸取上述供試品溶液適量，置10mL量瓶中，用水稀釋到刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，精密吸取10μL注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖。對(duì)不同批次HPLC色譜圖進(jìn)行解析，確定共有峰，構(gòu)建樣品的HPLC色譜圖的指紋特征。采用MATLAB軟件對(duì)各樣品色譜圖的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以6批樣品生成的對(duì)照譜圖作為對(duì)照模版，計(jì)算各色譜圖的整體相似度，6批樣品相似度分別為 0.9905，0.9934，0.9897，0.9934，0.9964，0.9985。精密吸取羥基紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、原兒茶醛對(duì)照品溶液與供試品溶液各10uL，分別進(jìn)樣測(cè)定，確定指紋色譜圖中的6號(hào)峰為羥基紅花黃色素A，9號(hào)峰為丹參素，10號(hào)峰為原兒茶醛，14號(hào)峰為丹酚酸B。

2.8 結(jié)果

丹參和紅花不同提取方法所得提取液共有模式指紋圖譜見(jiàn)圖1。從整體角度判斷，以兩藥合提所得提取液指紋圖譜中的主要色譜峰為基準(zhǔn)，與兩藥分別提取再合并所得提取液的圖譜做比較，發(fā)現(xiàn)兩藥分提與合提的指紋圖譜中主要色譜峰數(shù)目一致，保留時(shí)間基本相同，峰面積基本相等。初步斷定丹參、紅花分提與合提，其主要化學(xué)成分沒(méi)有發(fā)生變化。

3 討論

采用UV檢測(cè)器對(duì)指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行選擇，結(jié)果表明，檢測(cè)波長(zhǎng)377nm處，所得各色譜峰具有代表性，信息量較大，各色譜分離度好。故選用377nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。采用不同的洗脫系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)相的組成進(jìn)行優(yōu)化，最終選用2.1項(xiàng)下的流動(dòng)相組成進(jìn)行梯度洗脫，各色譜分離度好，基線平穩(wěn)。本文比較了Kromasil C18100－5(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱和迪馬公司 Diamonsil(鉆石)C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，從指紋圖譜整體信息比較來(lái)看，Kromasil柱所得圖譜和Diamonsil柱所得圖譜的差異不大，色譜的整體性相似。從戴安UitiMate 3000高效液相色譜儀和美國(guó)Agilent－1100型高效液相色譜儀所得指紋圖譜的整體性和模糊性上來(lái)看，整體信息基本相似，說(shuō)明指紋圖譜在不同儀器上的“相似性”。故本文的HPLC指紋圖譜在不同型號(hào)儀器和不同色譜柱上具有良好的重現(xiàn)性。

圖1 丹參紅花合提和分提所得提取液共有模式圖譜

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，丹參、紅花 (按3∶1的比例)兩藥分別提取后，再將提取液合并與兩藥合提的主要化學(xué)成分的種類和峰面積基本一致。這說(shuō)明丹參、紅花兩藥分別提取后，將提取液合并與兩藥合提對(duì)主要化學(xué)成分的種類和含量幾乎沒(méi)有影響。

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