彭 巖，殷盛明，于德欽，徐 紅，董方圓，唐 錦，孫藝平，張萬琴

(1.大連醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，2.大連醫(yī)科大學(xué)機能實驗室，3.大連醫(yī)科大學(xué)2006/7級學(xué)生，遼寧 大連 116044)

帕金森病(Parkinson's Disease，PD)是一種與年齡相關(guān)的中老年慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。PD主要病理改變是中腦多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元及黑質(zhì)—紋狀體通路進行性變性。PD起病緩慢，其早期發(fā)病可能長達10年之久[1]。只有當(dāng)中腦DA能神經(jīng)元變性死亡達50%時，病人才開始出現(xiàn)臨床癥狀[2]。因此有關(guān)PD的早期發(fā)病機制及早期診斷方面的研究尤為重要。

目前，PD早期發(fā)病機制尚不清楚，而相關(guān)研究很少，主要由于臨床上很難收集到未出現(xiàn)臨床癥狀而又處于PD無病期和臨床前期的病例，因此只能借助于早期PD動物模型。6-OHDA注射入大鼠紋狀體將引起為期數(shù)周的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)緩慢的逆行性退行性變，小劑量單側(cè)紋狀體內(nèi)注射法可建立具有PD早期特征的動物模型[3]。

本研究采用6-OHDA大鼠早期PD模型，觀察PD發(fā)病早期大鼠中腦內(nèi)DA能神經(jīng)元的損傷情況，進一步觀察血清總抗氧化能力及血清抑制羥自由基能力。這將為PD早期發(fā)病機制及早期診斷提供線索。

1 材料與方法

1.1 PD動物模型制備和分組

選用健康雄性SD大鼠(大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)，體重180～220g，實驗動物隨機分為兩組(n=11):對照組和早期PD組。所有實驗動物用4%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀上，門齒桿3.4 mm。根據(jù)George Paxinos&Charles Watson大鼠腦定位圖譜選取靶點，注射靶點為紋狀體，坐標(biāo)定位為AP=+1.0，R=3.0mm(向右旁開)，H=-4.5 mm(硬膜下)。早期PD組動物腦內(nèi)注射溶解于Vehicle(0.1%抗壞血酸，0.9%NaCl)的 6-OHDA，20μg/3μl。注射時間約3 min，留針3 min后慢慢退出。對照組動物在相同條件下，靶點內(nèi)分別給以同等容積的Vehicle。

1.2 動物行為學(xué)檢測

上述處理后兩周，實驗動物全部于頸背部皮下注射溶于0.4 ml生理鹽水中的阿樸嗎啡(apomorphine，Apo 0.5mg/kg)，誘發(fā)旋轉(zhuǎn)運動，記錄30min的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，視7 r/min以下的左旋鼠為成功的早期PD大鼠模型。旋轉(zhuǎn)運動測試后進行下述邁步實驗的測試。

邁步實驗:選擇一個1.1 m長，傾斜放置的木板，木板的一端連通鼠籠。實驗開始前3 d，先讓鼠對實驗環(huán)境有所適應(yīng)，并設(shè)法訓(xùn)練大鼠慢慢爬回到籠中。實驗開始后，實驗者一只手固定大鼠雙后肢并輕輕上提，使其離開桌面，另一只手固定一側(cè)前肢，讓未固定的一側(cè)前肢接觸桌面。待該前肢自動移動時，開始計時。記錄從開始邁步到回到鼠籠所需要的總時間。同時記錄走過整個斜面的步數(shù)。檢測順序為先左側(cè)后右側(cè)，并重復(fù)2次，共測試3 d。

1.3 血清羥自由基測定

行為實驗測試結(jié)束后，實驗動物進行眼球取血，血漿在測試前3500r/min離心10min，取上清待測。血清樣本用生理鹽水20倍稀釋后取0.2 ml作檢測。按照南京建成生物公司試劑盒說明，用Fenton反應(yīng)和griess試劑顯色法測定抑制血清羥自由基能力。

1.4 總抗氧化能力測定

取樣品方法同上，按照南京建成生物公司試劑盒說明，用菲啉類物質(zhì)顯色法測定血清總抗氧化能力。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

取血后的實驗動物用4%甲醛固定，取腦組織經(jīng)4%甲醛固定，蔗糖脫水后進行冰凍切片，再行ABC法免疫組織化學(xué)染色。選取中腦黑質(zhì)腦片，經(jīng)PBS振蕩漂洗10min×3，用含1%過氧化氫的PBS處理10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶。PBS振蕩漂洗10min×3后用含1%牛血清蛋白的PBS封阻20min。加入抗TH抗體。4℃孵育過夜;PBS漂洗10min×3;生物素化的二抗室溫孵育1.5 h;漂洗后與卵白素-生物素復(fù)合物A∶B∶PBS(1∶1∶200)室溫振蕩孵育1 h，充分漂洗后用新鮮配制的0.05%的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)-PBS緩沖液加0.02%過氧化氫顯色，適時終止反應(yīng)。腦片進行貼片、晾干、二甲苯透明和中性樹脂封片。

1.6 免疫染色陽性細胞的計數(shù)

用病理圖文分析系統(tǒng)對TH-IR陽性細胞進行定量計數(shù)。選取各組大鼠 6只。腦片的選取部位根據(jù)George Paxinos&Charles Watson大鼠腦圖譜，先在10倍的物鏡下觀察腦片，選取黑質(zhì)致密部(SNR)，在熒光屏上設(shè)定測量框的面積為20000μm2(100μm×200μm)，選取四個部位計數(shù)，取其平均值。計算測量框內(nèi)TH-IR陽性細胞的個數(shù)。并隨機選6個TH-IR陽性細胞，測其胞漿平均灰度。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果

在邁步實驗中，與對照組相比，早期PD動物在左前肢從開始邁步至返回鼠籠所需要的總時間和所邁的步數(shù)沒有明顯差異(表1，表2)。

Tab.1 Total time since the rat walked back to the cage by using the left forelimb(，n=11)

Tab.1 Total time since the rat walked back to the cage by using the left forelimb(，n=11)

Group Times(s)Day1 Day2 Day3 Control 5.00±0.56 4.83±0.56 3.42±0.34 Early PD 5.14±0.64 5.00±0.46 4.07±0.97

Tab.2 Total number of steps since the rat walked back to the cage by using the left forelimb(，n=11)

Tab.2 Total number of steps since the rat walked back to the cage by using the left forelimb(，n=11)

Group Number of steps Day1 Day2 Day3 Control 9.17±0.90 9.75±0.75 8.92±0.67 Early PD 9.14±0.52 9.29±0.36 8.07±0.73

2.2 TH免疫組化結(jié)果

與對照組給藥側(cè)相比，早期PD大鼠黑質(zhì)給藥側(cè)TH-IR陽性DA能神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少，光密度明顯降低，免疫反應(yīng)活性明顯減弱(圖1D，表3，4)。

Fig.1 The results of the TH-IR positive dopaminergic neurons(DAB staining，bar=100μm)

Tab.3 Number of the TH-IR positive dopaminergic neurons in the substantial nigra counting area is 20000μm2(100μm ×200μm)(，n=11)

Tab.3 Number of the TH-IR positive dopaminergic neurons in the substantial nigra counting area is 20000μm2(100μm ×200μm)(，n=11)

**P＜0.01 vs control in the treated side

Group Number of neurons Untreated side Treated side Control 8.50±1.38 8.33±1.21 Early PD 5.17±1.33 4.00±1.55**

Tab.4 Optical density of the TH-IR positive dopaminergic neurons in the substantial nigra(，n=11)

Tab.4 Optical density of the TH-IR positive dopaminergic neurons in the substantial nigra(，n=11)

**P＜0.01 vs control in the treated side

Group Optical density Untreated side Treated side Control 0.81±0.01 0.81±0.02 Early PD 0.83±0.01 0.69±0.02**

2.3 血清抗氧化能力

與對照組相比，早期PD大鼠血清的抑制羥自由基能力及總抗氧化能力明顯降低(表5，6)。

Tab.5 Inhibition ability of hydroxyl free radical in the serum(，n=11)

Tab.5 Inhibition ability of hydroxyl free radical in the serum(，n=11)

**P＜0.01 vs control

Group Inhibition ability(U/ml)Control 672.85±9.61 Early PD 616.65±32.91**

Tab.6 Total antioxidation ability in the serum(，n=11)

Tab.6 Total antioxidation ability in the serum(，n=11)

**P＜0.01 vs control

Group Total antioxidation ability(U/ml)Control 9.15±0.61 Early PD 6.18±0.55**

3 討論

PD是中老年人常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，隨著人口的老齡化，以及環(huán)境及食品等可能的相關(guān)因素的影響，近20年中國PD發(fā)病率至少增長了20多倍。PD起病緩慢，臨床前期時間長。[3]。PD早期由于缺乏特征性的臨床癥狀，難以診斷;而臨床期PD雖診斷明確，從治療的角度出發(fā)，已為時過晚。因此，對PD早期發(fā)病機制及早期診斷的研究具有十分重要的社會意義。

PD的病因和發(fā)病至今不清，很可能是多種因素長期作用的結(jié)果，包括基因突變、接觸環(huán)境毒物(如魚藤酮、MPTP、6-OHDA等)、腦內(nèi)炎癥反應(yīng)和免疫功能失調(diào)等，它們都可能使DA能神經(jīng)元對氧化應(yīng)激和能量缺乏更加敏感。雖然PD是以腦內(nèi)DA能神經(jīng)元變性為主要病理特征，但近年來研究發(fā)現(xiàn)PD的外周組織細胞也檢測出異常改變。Parker等1989年首例報道PD病血小板中存在線粒體復(fù)合物1活性明顯降低，還有研究發(fā)現(xiàn)PD患者骨骼肌、淋巴細胞、成纖維細胞中酶復(fù)合物Ⅰ活性下降，提示PD患者的線粒體功能異?？赡苁侨硇缘腫4]。這為早期診斷PD提供了思路，線粒體功能與機體的抗氧化能力密切相關(guān)[5]，但有關(guān)血清總抗氧化能力及血清抑制羥自由基的能力在PD早期是否有異常改變，尚未見報道。

本研究采用小劑量單側(cè)紋狀體內(nèi)注射法建立早期PD動物模型，經(jīng)動物行為學(xué)邁步實驗及旋轉(zhuǎn)行為檢測與對照組無明顯改變，證實為可靠的早期PD動物模型。本研究發(fā)現(xiàn)在6-OHDA給藥側(cè)，與對照組相比，PD早期動物中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元免疫反應(yīng)活性降低，進一步發(fā)現(xiàn)PD早期動物的血清總抗氧化能力及血清抑制羥自由基的能力降低。因此推測血清抗氧化能力的降低可能是PD早期病變的標(biāo)志，這些異常改變可能與早期PD大鼠中腦DA能神經(jīng)元損傷機制有關(guān)。這對PD發(fā)病機制及早期診斷的研究提供重要的理論依據(jù)和線索。

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[2]Felicio A C，Shih M C，Godeiro-Junior C，et al.Molecular imaging studies in Parkinson disease:reducing diagnostic uncertainty[J].Neurologist，2009，15(1):6-16.

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[5]王琳琳，凌文華.線粒體DNA氧化損傷機制的探討[J].疾病控制雜志，2000，4(1):79-83.