楊 燁，張春燕，王 斌，林海英，鄔麗莎△

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，2.瀘州市人民醫(yī)院心內(nèi)科，3.瀘州醫(yī)學(xué)院生理教研室，四川 瀘州 646000)

藥物成癮是由于濫用藥物與大腦獎(jiǎng)賞系統(tǒng)相互作用產(chǎn)生的慢性、復(fù)發(fā)性腦疾病，有著極其復(fù)雜的機(jī)制。其主要原因就是形成了成癮記憶[1]。因此，了解有成癮特征化的學(xué)習(xí)和記憶機(jī)制對(duì)探求成癮的本質(zhì)具有重要意義。Berke等人的研究發(fā)現(xiàn)，前額葉皮層(prefrontal cortex，PFC)等多種神經(jīng)元回路參與藥物成癮有關(guān)的學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程[1]，并與已知的記憶儲(chǔ)存相關(guān)通路有很多相似之處。因此，在對(duì)成癮記憶機(jī)制的闡明中，這些部位將為成癮研究打開(kāi)重要的突破口，并為其治療開(kāi)辟新的途徑。

已有研究表明:PFC參與了物質(zhì)成癮相關(guān)的認(rèn)知、行為和情緒變化的調(diào)節(jié)和控制[2]。功能的改變，必然涉及蛋白的改變，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，獲得嗎啡成癮大鼠與自然戒斷大鼠PFC蛋白質(zhì)圖譜。通過(guò)對(duì)這些圖譜進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)差異分析并結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)資料，確定與嗎啡成癮及自然戒斷相關(guān)的PFC蛋白質(zhì)成分的表達(dá)改變，為進(jìn)一步明確阿片類藥物成癮機(jī)制，特別是防止戒斷后“復(fù)吸”提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康雄性SD大鼠30只，質(zhì)量180～220g。由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科提供。隨機(jī)分為成癮組、戒斷組和正常對(duì)照組，每組10只。清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。

1.2 嗎啡成癮及自然戒斷大鼠模型建立

采用連續(xù)5 d背部皮下遞增注射鹽酸嗎啡方法建立大鼠嗎啡成癮模型，每日給藥量依次為 5、10、20、40、50mg/kg，每天3 次(8∶00，12∶00，16∶00)，對(duì)照組按同樣方式注射生理鹽水。末次注射嗎啡2 h后，動(dòng)物腹腔注射2 mg/kg的納洛酮進(jìn)行催促戒斷，記錄1 h內(nèi)動(dòng)物出現(xiàn)的可數(shù)戒斷癥狀及體質(zhì)量變化情況。以改進(jìn)的柳田知司評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)記錄癥狀及體質(zhì)量變化進(jìn)行評(píng)分，作為判斷成癮的指標(biāo)。對(duì)照組大鼠給予同樣處理和評(píng)分。確認(rèn)嗎啡依賴后，成癮組給予每天1次(8∶00)30mg/kg鹽酸嗎啡背部皮下注射1周。戒斷組采取自然戒斷法，僅給予同等量生理鹽水注射1周。第13天8∶00觀察大鼠的自然戒斷癥狀并參照Koob嗎啡成癮大鼠軀體癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。

1.3 雙向電泳分離大鼠PFC總蛋白，蛋白樣品制備及雙向電泳

上述處理完畢后，根據(jù)催促戒斷反應(yīng)驗(yàn)證嗎啡成癮大鼠模型成功建立。3組各取5只大鼠迅速斷頭處死，參照大鼠腦立體定位圖譜，冰臺(tái)上迅速分離PFC腦組織，去除腦膜，預(yù)冷三蒸水洗去血漬，濾紙吸去多余液體，移入勻漿器，加入細(xì)胞裂解液400μl后4℃震蕩30min;4℃、12000r/min離心1 h，收集的上清液即為蛋白質(zhì)提取物。用Bradford法測(cè)定各樣品的總蛋白含量，分裝，-80℃保存，備用。采用17 cm的線性IPG預(yù)制干膠條(pH 4～7)，每根膠條上樣量100μg，按照Bio-Rad公司說(shuō)明書進(jìn)行第一向固相pH梯度等電聚焦，總伏時(shí)數(shù)約為80000。隨后按常規(guī)方法進(jìn)行第二向SDS-PAGE。

1.4 差異蛋白的篩選和質(zhì)譜鑒定

采用銀染法對(duì)雙向電泳后的凝膠進(jìn)行染色。采用ImageMaster 2D Platinum v5.0軟件進(jìn)行成癮組、戒斷組和對(duì)照組蛋白質(zhì)的差異分析，經(jīng)過(guò)與對(duì)照組蛋白斑點(diǎn)的匹配和對(duì)比分析，初步篩選出成癮組和戒斷組差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，即表達(dá)量的增加或減少具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白斑點(diǎn)。取實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量增高達(dá)5倍以上的差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)4個(gè)，膠內(nèi)酶切，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸附離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)鑒定，獲得2個(gè)蛋白斑點(diǎn)的肽指紋圖譜。再結(jié)合這些蛋白斑點(diǎn)的pI和MW等信息，使用肽指紋圖譜匹配軟件Mascot檢索匹配GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)的鑒定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型的建立

隨機(jī)選取的大鼠注射納洛酮1 h內(nèi)均出現(xiàn)濕狗樣顫抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、跳躍、齒顫、腹瀉和體質(zhì)量下降等戒斷癥狀，評(píng)分也明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。證明嗎啡成癮大鼠模型成功建立。

2.2 各組行為表現(xiàn)

戒斷一周組與正常對(duì)照組比較有非常顯著性差異，嗎啡成癮組與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(表1)。

Tab.1 Behavior of rats in each group(，n=10)

Tab.1 Behavior of rats in each group(，n=10)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Symptoms Wet dog shakes Writhing Penile licking Jumping Teeth chattering Grooming Rearing Control 0.67±0.52 0 0.67±1.820.67±0.52 0 1.33±0.52 1.33±0.52 Morphine-addicted 1.33±0.52* 0 1.33±0.52*1.00±0.62* 0 2.67±0.52* 1.83±0.75*Morphine-withdrawal123.30±1.75**18.80±1.42**19.80±1.02**3.83±0.75**8.33±1.03**9.33±1.64**11.03±0.89**

2.3 成癮組和戒斷組大鼠PFC蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜分析

比較成癮組和戒斷組與正常對(duì)照組的雙向電泳圖譜，可見(jiàn)成癮組和戒斷組表達(dá)蛋白質(zhì)組圖譜發(fā)生了明顯的改變，主要表現(xiàn)為雙向電泳圖譜中蛋白斑點(diǎn)數(shù)量的增減和灰度值的變化。通過(guò)ImageMaster 2D Platinum v5.0軟件對(duì)2-DE圖譜的蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，成癮組共檢獲蛋白斑點(diǎn)287個(gè);戒斷組共檢獲蛋白斑點(diǎn)296個(gè)。經(jīng)蛋白斑點(diǎn)的匹配和對(duì)比分析，成癮組差異表達(dá)(增高或降低))的蛋白斑點(diǎn)總數(shù)為87個(gè)，戒斷組差異表達(dá)(增高或降低))的蛋白斑點(diǎn)總數(shù)為79個(gè)，絕大多數(shù)集中于pH 4.2～6.8的偏酸性區(qū)域，相對(duì)分子量介于 30～ 110kDa(圖 1A、B、C)。

Fig.1 2-DE maps of proteome from PFC of morphine-addicted/withdrawal rats and normal rats

2.4 蛋白斑點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

通過(guò)ImageMaster 2D Platinum v5.0軟件匹配及對(duì)比分析，篩選出成癮組表達(dá)量增高達(dá)5倍以上的蛋白斑點(diǎn)共計(jì)4個(gè)進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)鑒定，獲得了2個(gè)蛋白斑點(diǎn)的肽指紋圖譜(圖2 B、C)。采用Mascot軟件將各蛋白斑點(diǎn)的肽指紋圖譜與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知蛋白的標(biāo)準(zhǔn)肽指紋圖譜相比對(duì)，獲得各蛋白斑點(diǎn)的鑒定結(jié)果(圖1B，表2)

3 討論

PFC作為與藥物成癮相關(guān)的重要中樞，必然在嗎啡成癮及戒斷的過(guò)程中發(fā)生適應(yīng)性的病理改變。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究不同個(gè)體不同時(shí)間的中樞神經(jīng)系統(tǒng)蛋白質(zhì)表達(dá)變化，已經(jīng)成為神經(jīng)功能研究的重要方向。

Fig.2 Peptide mass fingerprinting of 2 protein spots from 2-DE map of morphine-addicted group

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)成癮大鼠PFC蛋白樣品雙向電泳圖譜分析、MALDI-TOF-MS及生物信息學(xué)分析鑒定，并結(jié)合種屬特異性在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定了2個(gè)有意義的嗎啡成癮組大鼠上調(diào)而戒斷組及正常對(duì)照組大鼠下調(diào)的PFC蛋白斑點(diǎn):(1)Snap 25 亞型 β-Snap25突 觸相關(guān)蛋白 25(Snap25 isoform β-Snap25 of synaptosomal-associated protein 25，β-Snap)是突觸前胞膜蛋白，在PFC和其他腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞中高度表達(dá)，是胞吐裝置SNARE核心復(fù)合體的組成成分，介導(dǎo)突觸囊泡的錨定和融合，在神經(jīng)遞質(zhì)的釋放中起重要作用，并參與突觸可塑性的調(diào)節(jié)[3]。(2)β-肌動(dòng)蛋白(actb actin，cytoplasmic 1)是幫助形成細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)蛋白，用于維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度。

趙艷梅等[4]通過(guò)Western blot測(cè)定嗎啡處理不同狀態(tài)下γ-Snap的蛋白表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性嗎啡依賴大鼠尾殼核內(nèi)γ-Snap蛋白表達(dá)上調(diào)約1.24倍(P＜0.05)，自然戒斷2 d后γ-Snap蛋白表達(dá)下降至正常水平，在自然戒斷 3、7 d時(shí)與對(duì)照組相比無(wú)變化。β-Snap和γ-Snap均屬于SNAPs蛋白家族，參與細(xì)胞內(nèi)膜的融合和囊泡移動(dòng)。越來(lái)越多的研究表明，SNAPs在鈣依賴的胞吐機(jī)制和神經(jīng)遞質(zhì)釋放過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究中已鑒定的成癮組差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)1即為β-Snap，在成癮組上調(diào)而戒斷組下調(diào)，與之研究結(jié)果一致。說(shuō)明嗎啡成癮引起該蛋白表達(dá)上調(diào)，在成癮損害相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、軸突生長(zhǎng)和突觸形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Procaccio等[5]研究發(fā)現(xiàn)大腦細(xì)胞中結(jié)構(gòu)蛋白—β-肌動(dòng)蛋白的突變體與耳聾及肌張力障礙相關(guān)。突變體由于蛋白質(zhì)的構(gòu)象的改變不能結(jié)合ATP，引起細(xì)胞受損和死亡，最終導(dǎo)致大腦神經(jīng)組織的損害。本研究中已鑒定的成癮組差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)2即為β-肌動(dòng)蛋白，說(shuō)明嗎啡成癮大鼠神經(jīng)組織β-肌動(dòng)蛋白可能發(fā)生突變，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的供能障礙，與成癮相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞能量代謝變化相關(guān)。總之，上述已鑒定的與嗎啡成癮差異表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)涉及神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、軸突生長(zhǎng)和突觸形成、細(xì)胞能量代謝等方面，將有助于更好的闡明阿片類藥物依賴形成的分子機(jī)制。

Tab.2 Proteins differentially expressed among morphine-addicted and withdrawal rats and normal rats identified by MS analysis

[1]Berke J D，Hyman S E.Addiction，dopamine，and the molecular mechanisms of memory[J].Neuron，2000，25(3):515-532.

[2]Davidson R J，Jackson D C，Kalin N H.Emotion，plasticity，context，and regulation:perspectives from affective neuroscience[J].Psychol Bull，2000，126(6):890-909.

[3]Zhang H M，Su Q，Luo M.Thyroid hormone regulates the expression of SNAP-25 during rat brain development[J].Mol Cell Biochem ，2008，307(1-2):169-175.

[4]趙艷梅，吳 寧，李 錦.慢性嗎啡依賴及戒斷對(duì)大鼠不同腦區(qū)NSF附著蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(5):616-621.

[5]Procaccio V，Salazar G，Ono S.A mutation of beta-actin that alters depolymerization dynamics is associatedwith autosomal dominant developmental malformations，deafness，and dystonia[J].Am J Hum Genet，2006，78(6):947-960.