潘孝貴

(湖州師范學(xué)院體育學(xué)院,浙江 湖州 313000)

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)為37個氨基酸殘基組成的神經(jīng)肽,是目前已知最強(qiáng)的舒血管物質(zhì),具有顯著的心臟保護(hù)作用[1]。動物實(shí)驗(yàn)表明,長期耐力訓(xùn)練后心臟CGRP含量顯著提高,提示CGRP可能參與運(yùn)動誘導(dǎo)的心臟保護(hù)作用。本研究擬在耐力訓(xùn)練和力竭運(yùn)動動物模型的基礎(chǔ)上,探討CGRP在運(yùn)動誘導(dǎo)的心臟保護(hù)中的作用及其機(jī)制,為體育鍛煉預(yù)防和治療心血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

64只健康雄性SD大鼠(上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供),體重205 g±12 g。常規(guī)分籠喂養(yǎng),室溫22℃±2℃,濕度45%±10%,光照12 h/d,標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料飼養(yǎng),自由飲食。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)和跑臺練習(xí)1周后將大鼠按體重分層,隨機(jī)分為對照組(CG,n=16),耐力訓(xùn)練組(TG,n=16),力竭運(yùn)動組(EG,n=16),耐力訓(xùn)練+力竭運(yùn)動組(TEG,n=16)。CG不加干預(yù);TG進(jìn)行10周的耐力訓(xùn)練;EG只進(jìn)行連續(xù)3 d的力竭運(yùn)動;TEG完成耐力訓(xùn)練后48 h,再進(jìn)行連續(xù)3 d的力竭運(yùn)動。耐力訓(xùn)練計劃按照Powers[2]實(shí)驗(yàn)方案。訓(xùn)練以自主運(yùn)動為主,偶爾給予電刺激,每次訓(xùn)練結(jié)束后即刻給予巧克力(每只0.5 g),以激勵大鼠運(yùn)動。在10周耐力訓(xùn)練后48 h,TEG和EG動物進(jìn)行連續(xù)3 d的力竭運(yùn)動,以誘導(dǎo)心肌損傷。力竭運(yùn)動包括5 min的熱身,逐漸增加跑臺速度至30m/min,坡度至6°,然后維持該運(yùn)動強(qiáng)度,直至力竭。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

CG和TG在最后一次耐力訓(xùn)練48 h后取材,EG和TEG在力竭運(yùn)動后即刻取材。所有大鼠戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg,腹腔注射),腹主動脈取血,離心后取血清,-20℃保存待測。取血后,每組隨機(jī)抽8只大鼠經(jīng)左心室灌注固定,制備心肌石蠟切片,其余8只大鼠迅速取心臟,經(jīng)預(yù)冷滅菌生理鹽水清洗后,濾紙吸干,置液氮保存,待測。

心肌組織CGRP免疫反應(yīng)產(chǎn)物分布和表達(dá)采用免疫組織化學(xué)方法(SABC法)。一抗為山羊抗人CGRP(1∶400),由Santa Cruz公司提供,SABC試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。染色結(jié)果定量分析采用 Image-pro Plus圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司)。

缺血低氧染色采用蘇木素堿性復(fù)紅苦味酸染色法(HBFP染色)。

血清心肌肌鈣蛋白I濃度(cardiac troponin I,cTnI)測定采用免疫化學(xué)發(fā)光法。一抗為抗人心肌肌鈣蛋白I抗體。正常大鼠血清cTnI約為0.45 ng/ml。

心肌NO、SOD、MDA測定試劑盒由南京建成生物工程公司提供。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 心肌CGRP分布與表達(dá)、缺血低氧染色

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明,CGRP免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色,心房肌、心室肌、心內(nèi)膜、心外膜、冠狀動脈及其各級分支等處均有分布。其中冠狀動脈周圍、心房肌組織中分布較多,心室肌組織中較稀少,心外膜處可見強(qiáng)陽性反應(yīng),見圖1 A-D。計算機(jī)圖像分析表明,TGCGRP免疫反應(yīng)面積和平均光密度均顯著大于CG(P<0.05)。與CG比較,EG組CGRP免疫反應(yīng)面積沒有顯著差異,平均光密度顯著下降(P<0.05);與TG比較,TEG組組CGRP免疫反應(yīng)面積和平均光密度均顯著下降(P<0.05,表1)。

CG和TG正常心肌纖維細(xì)胞漿呈黃色,染色均勻(圖2 A)。EG心肌纖維結(jié)構(gòu)模糊,著色不均,細(xì)胞漿內(nèi)有較多的呈斑點(diǎn)狀或片狀的缺血低氧部位,部分甚至融合成大片致密濃染(圖2 B、C)。TEG組出現(xiàn)輕微的缺血低氧改變(圖2 D)。

Fig.1 IHC staining of CGRP in rat hearts(×400)

Fig.2 HBFP staining in cardiac tissues(×400)

Tab.1 Image analysis result of CGRP IR(,n=5)

Tab.1 Image analysis result of CGRP IR(,n=5)

CG:Control group;EG:Exhaustive group;TG:Training group;TEG:Training and exhaustive group＊P<0.05vsCG;#P<0.05vsTG

Group Positive area(μm2) Average optical density(OD)CG 36.31±15.06 106.86±14.58 EG 34.27±14.21 84.54±21.27＊TG 52.31±26.05＊ 117.02±12.00＊TEG 40.31±18.26# 90.29±16.09#

2.2 血清心肌肌鈣蛋白I的變化

如表2所示,EG大鼠血清心肌肌鈣蛋白I濃度較CG顯著升高(P<0.05),達(dá)11倍多,且超過了心肌損傷的臨界值。

Tab.2 Changes of serum cTnI(,n=16)

Tab.2 Changes of serum cTnI(,n=16)

CG:Control group;EG:Exhaustive group;TG:Training group;TEG:Training and exhaustive group＊P<0.05vsCG

Group Serum cTnI(ng/ml) Increased ratio CG 0.08±0.05 11.37 EG 0.99±0.16＊TG 0.18±0.05 0.54 TEG 0.29±0.06

2.3 心肌抗氧化能力和NO的變化

由表3可知,經(jīng)過10周耐力訓(xùn)練后,TG心肌SOD總活性顯著高于CG(P<0.01)。與CG比較,EG心肌SOD總活性顯著降低(P<0.01),MDA顯著增加(P<0.01),NO含量顯著下降(P<0.01);TEG組與TG比較,心肌SOD總活性顯著降低(P<0.01),MDA含量顯著增加(P<0.01)。

Tab.3 Changes of total SOD,MDA and NO in hearts( ,n=16)

Tab.3 Changes of total SOD,MDA and NO in hearts( ,n=16)

CG:Control group;EG:Exhaustive group;TG:Training group;TEG:Training and exhaustive group＊＊P<0.01vsCG;##P<0.01vsTG

Group SOD(U/mg pro)MDA(nmol/mg pro)NO(μmol/g pro)CG 118.48±25.38 20.07±5.71 2.28±0.59 EG 75.01±26.47＊＊ 31.45±7.13＊＊ 1.44±0.25＊＊TG 394.16±49.26＊＊ 19.84±4.10 2.72±0.24 TEG 242.36±42.12##25.15±9.50## 2.26±0.48

3 討論

目前研究表明,中等強(qiáng)度的運(yùn)動訓(xùn)練能夠引起血漿和心肌中CGRP產(chǎn)生和分泌水平的升高,超負(fù)荷的運(yùn)動訓(xùn)練則使心血管CGRP釋放過多,含量下降,推測CGRP是運(yùn)動誘導(dǎo)的心臟保護(hù)作用的重要介質(zhì)之一[3]。本研究發(fā)現(xiàn),耐力訓(xùn)練組心臟CGRP免疫反應(yīng)明顯增強(qiáng),經(jīng)過連續(xù)3 d的力竭運(yùn)動后,大鼠心臟CGRP免疫反應(yīng)明顯減弱,未經(jīng)訓(xùn)練大鼠血清心肌肌鈣蛋白I顯著升高,心肌出現(xiàn)較明顯的缺血低氧改變,而耐力訓(xùn)練組大鼠則沒有上述改變。提示,力竭運(yùn)動使心臟中CGRP消耗過多,產(chǎn)生心肌細(xì)胞損傷性改變;耐力訓(xùn)練提高了心臟局部CGRP的含量,促使心肌收縮力增強(qiáng),冠狀循環(huán)和心肌局部供血改善,提高了心臟對力竭運(yùn)動的耐受能力,具有心臟保護(hù)作用。

譚建新[4]發(fā)現(xiàn),CGRP治療能改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的氧化損傷,減少心肌酶CK、LDH的漏出,減輕心肌細(xì)胞損傷程度,抗膜脂質(zhì)過氧化可能是其重要機(jī)制。本研究結(jié)果顯示,耐力訓(xùn)練大鼠心肌SOD總活性顯著高于對照組;力竭運(yùn)動后,未受訓(xùn)練的大鼠和耐力訓(xùn)練的大鼠心肌SOD活性均顯著降低,與心肌CGRP含量變化趨勢相一致。提示,耐力訓(xùn)練可能通過提高心肌CGRP含量,上調(diào)心肌SOD活性,降低力竭運(yùn)動時心肌氧化應(yīng)激水平,起到心肌保護(hù)作用。

大量研究發(fā)現(xiàn),NO與CGRP在調(diào)節(jié)血流方面有協(xié)同作用,并可相互促進(jìn)釋放:外源性NO及內(nèi)源性的NO均可促進(jìn)CGRP的釋放,CGRP通過cAMP途徑上調(diào)NOS產(chǎn)生NO[5]。本研究發(fā)現(xiàn),耐力訓(xùn)練大鼠與未經(jīng)訓(xùn)練大鼠心肌NO含量沒有顯著差異,但連續(xù)3天的力竭運(yùn)動后,未經(jīng)訓(xùn)練的大鼠心肌NO含量顯著減少,而耐力訓(xùn)練的大鼠沒有顯著變化。提示,未經(jīng)訓(xùn)練的大鼠由于心臟CGRP儲備低,力竭運(yùn)動過程中逐漸耗竭,促NO合成能力下降,心肌NO含量減少,冠脈擴(kuò)張效應(yīng)減弱,導(dǎo)致心臟冠脈灌流量不足,心肌出現(xiàn)缺血低氧性改變,心肌肌鈣蛋白I漏出。但經(jīng)過耐力訓(xùn)練的大鼠心臟CGRP儲備高,能持久釋放,促進(jìn)心肌NO合成,避免了力竭運(yùn)動誘導(dǎo)的心肌損傷。

[1]Brain SD,Grant A D.Vascular actionsof calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin[J].Physiol Rev,2004,84(3):903-934.

[2]Powers S K,Criswell D,Lawler J,et al.Rigorous exercise training increases superoxide dismutase activity in ventricular myocardium[J].Am J Physiol,1993,265(6 Pt 2):H2094-2098.

[3]潘孝貴,潘珊珊.降鈣素基因相關(guān)肽介導(dǎo)運(yùn)動心臟重塑的機(jī)制探討[J].上海體育學(xué)院學(xué)報,2007,31(1):54-57.

[4]譚建新,李巖松,黃宇戈,等.降鈣素基因相關(guān)肽對大鼠心肌缺血損傷的影響[J].中國病理生理雜志,2000,16(3):226-228.

[5]Garry M G,Walton L P,Davis M A.Capsaicin-evoked release of immunoreactive calcitonin gene-related peptide from the spinal cord is mediated by nitric oxide but not by cyclic G MP[J].Brain Res,2000,861(2):208-219.