李鵬飛，張 偉，馬 暢，張?jiān)词?/p>

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是人類及其他哺乳動(dòng)物心血管系統(tǒng)體液調(diào)節(jié)機(jī)制中的重要組成部分，其包括兩個(gè)軸:血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-血管緊張素Ⅱ-ATI受體軸(Angiotensin converting enzyme-AngiotensinⅡ-ATI Gx-ACE-AngII-AT1軸)和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-血管緊張素(1-7)-Mas受體軸(Angiotensin converting enzyme 2-Angiotensin(1-7)-Mas axis，ACE2-Ang(1-7)-Mas);前者主要是通過血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngII)引起血管收縮、血壓升高、促進(jìn)心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增生等效應(yīng)[1];后者作用與前者作用相反[2]?，F(xiàn)在關(guān)于ACE-AngII-AT1軸的研究比較多，但是關(guān)于ACE2-Ang(1-7)-Mas軸及兩條軸在高血壓時(shí)是如何變化的研究比較少。本研究通過觀察自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和與之匹配的正常Wistar-京都大鼠(WKY)心臟組織中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme，ACE2)表達(dá)的差異，并結(jié)合其相應(yīng)受體AT1受體(ATR)和Mas受體(MasR)及血液中AngII的變化，從基因和蛋白水平上探討R AS兩條通路在高血壓發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

AngII放免試劑盒(北京北方);Trizol試劑盒(南京天根);PCR引物(上海英駿);MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA抑制劑、隨機(jī)引物(南京生興)。SYBR Premix Ex Taq(南京博飛);BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天);ACE2(C-18)兔多克隆抗體(美國Santa Cruz)，羊抗兔IgG(武漢博士德)。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)與處理

14周齡雄性WKY和SHR各8只，體重300g左右(購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號:SCXK滬2007-0005)。兩組大鼠自由飲食，飼喂一周后用BSN-II多通道無創(chuàng)測壓系統(tǒng)測定收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)和心率(Heart rate，HR)，并稱重后斷頭取血，迅速取其心臟放入液氮，隨后轉(zhuǎn)入-80℃待測。

1.3 血漿AngII水平

放射免疫分析法測定血漿AngII水平。按說明書操作，F(xiàn)MJ-182放射免疫γ-計(jì)數(shù)器檢測各管沉淀物的放射性計(jì)數(shù)(cpm)。

1.4 大鼠心臟組織中ACE、AT1R、ACE2和MasR mRNA表達(dá)的Real-time PCR分析

1.4.1 樣品總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 Trizol一步法抽提大鼠心臟總RNA，比色法測定總RNA的濃度和純度。用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄樣品總RNA成為cDNA。

1.4.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI網(wǎng)上大鼠mR NA序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列及參數(shù)見表1。

1.4.3 PCR條件 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBRGreen染料法。PCR 反應(yīng)總體積為 25μl，包括 2μl cDNA，12.5μl SYBR Green Master Mix，2μl目的基因引物和 8.5μl滅菌三 蒸水 ;反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性1 min;94℃變性20s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)，各樣本結(jié)果均用其相應(yīng)的β-actin標(biāo)化，用相對△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.5 大鼠心臟組織中 ACE2的 Western blot分析

1.5.1 心臟總蛋白的提取及濃度測定 參照Gembardt F等人的方法提取大鼠心臟總蛋白。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。

1.5.2 電泳、轉(zhuǎn)印和抗體孵育 以 80μg總蛋白樣品上樣，經(jīng)聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過夜，洗膜;二抗室溫孵育 2 h，洗膜。

1.5.3 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)和拍照分析 ECL試劑作用于PVDF膜上，反應(yīng)3 min，然后于暗室中顯影和定影。凝膠成像系統(tǒng)半定量分析測得的灰度值，確定樣品中目的蛋白表達(dá)的相對含量。

Tab.1 Parameters of primer pairs for ACE ，AT1R，ACE2，MasR and β-actin genes

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重與血壓

SHR大鼠收縮壓和舒張壓均高于WKY大鼠，分別增加了38.2%和38.3%(P＜0.01)，兩組大鼠心率和體重沒有顯著差異(P＞0.05，表2)。

Tab.2 SBP，SDP，HR and BW of SHR andWKY(，n=8)

Tab.2 SBP，SDP，HR and BW of SHR andWKY(，n=8)

SBP:Systolic blood pressure;DBP:Diastolic blood pressure;HR:Heart rate;BW:body weight**P＜0.01 vs WKY

WKY SHR SBP(mmHg) 138.72±4.97 191.75±4.06**DBP(mmHg) 101.68±3.96 140.67±4.39**HR(/min) 391.67±26.61 455.67±14.47 BW(g) 340±6.38 327.5±6.2

2.2 大鼠血漿 AngII含量

與WKY大鼠相比，SHR大鼠血漿中AngII含量顯著升高(1.99±0.09 vs 2.60±0.08，P＜0.05)。

2.3 WKY和 SHR大鼠心臟組織中ACE，ACE2，AT1R和MasR mRNA的表達(dá)

SHR大鼠心臟中ACE2 mRNA的表達(dá)較WKY大鼠顯著降低(P＜0.05)，而ACE mR NA的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。心臟中ATR和MasR mRNA表達(dá)與WKY大鼠相比均有下降，但差異不顯著。

2.4 WKY和 SHR大鼠心臟中ACE2 Western blot結(jié)果

免疫印跡結(jié)果顯示，與WKY大鼠相比，SHR大鼠心臟ACE2蛋白含量均顯著下降(圖2，P＜0.05)。

Fig.1 Expression of ACE，AT1R，ACE2 andMasR mRNA in heart of SHR and WKY(n=8)

Fig.2 Protein expression of ACE2 in heart of SHR comparedwith WKY(n=8)

3 討論

高血壓是嚴(yán)重危害人類健康的一種疾病，人類高血壓發(fā)病中90%為原發(fā)性高血壓。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)與高血壓存在著很密切的關(guān)系，它是人類及其他哺乳動(dòng)物心血管系統(tǒng)體液調(diào)節(jié)的機(jī)制中的重要組成部分?，F(xiàn)已證明R AS的成員ACE基因多態(tài)性與高血壓有密切的關(guān)系，其能酶解AngⅠ生成AngII，過量AngII通過AT1受體可導(dǎo)致血管收縮、水鹽代謝失調(diào)等負(fù)面效應(yīng)。ACE2是新近發(fā)現(xiàn)的ACE的同源物，研究表明，ACE2的主要生物學(xué)效應(yīng)是降解AngII產(chǎn)生具有舒張血管、拮抗細(xì)胞增殖及抗炎癥作用的Ang(1-7)。Ang(1-7)拮抗作用主要是通過其特異性受體MasR受體結(jié)合實(shí)現(xiàn)。即ACE和ACE2是一對相抗衡、功能效應(yīng)相反的酶[3]?，F(xiàn)已證明RAS系統(tǒng)存在著兩條在生理作用上相互拮抗的通路:一條是ACE-AngII-AT1通路，引起血管收縮，血壓升高;另一條是ACE2-Ang(1-7)-Mas通路，引起血管舒張血壓下降。兩條通路失衡往往導(dǎo)致高血壓、心臟功能紊亂、糖尿病等疾病的發(fā)生。

ACE2與高血壓方面的研究已有很多;Ling Li[4]小組發(fā)現(xiàn)心肌肥大高血壓大鼠血壓升高的同時(shí)心肌組織中ACE2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，ACE/ACE2比值升高。在研究心衰竭和心肌梗死大鼠[5]時(shí)也得到了同樣的結(jié)果，他們認(rèn)為ACE2表達(dá)升高是對局部組織R AS激活的一種代償性補(bǔ)償，占主導(dǎo)作用的還是ACE。蔡冬梅等人的則發(fā)現(xiàn)，與WKY大鼠相比，SHR大鼠心肌組織ACE2 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著減低。本研究表明，與WKY大鼠相比，SHR大鼠心臟ACE2 mR NA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P＜0.05)，與蔡冬梅等人的結(jié)果一致，而ACE mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。

本試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，從ACE-AngII-AT1通路方面看，SHR大鼠心臟中ACE mRNA表達(dá)均顯著高于WKY大鼠(P＜0.05)，AT1受體mRNA表達(dá)沒有顯著性變化但有升高的趨勢(P＞0.05)，血漿中AngII含量顯著升高(P＜0.05)，即ACEAngII-AT1軸成升高趨勢。從ACE2-Ang(1-7)-Mas通路方面，SHR大鼠心臟中ACE2 mR NA和蛋白表達(dá)均顯著低于WKY大鼠(P＜0.05)，其相關(guān)受體Mas mRNA表達(dá)有相應(yīng)下降的趨勢。因此，我們認(rèn)為ACE和ACE2表達(dá)異常是引發(fā)高血壓病的一個(gè)重要原因。SHR大鼠高血壓的產(chǎn)生，其機(jī)理一方面可能是ACE-AngII-AT1通路的過度激活加速了AngII的生成;另一方面ACE2表達(dá)降低又減少了AngII的降解和Ang(1-7)的生成，即高血壓時(shí)ACE-AngII-AT1R軸起主導(dǎo)作用。但其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

[1]Chappel M C，F(xiàn)errario C M.ACE and ACE2:their role to balance the expression of angiotensinII and angiotensin-(1-7)[J].Kidney Int，2006，70(1):8-10.

[2]Fernandes L，F(xiàn)ortes Z B，Nigro D，et al.Potentiation of bradykinin by angiotensin 1-7 on arterioles of spontaneously hypertensive rats studied in vivo[J].Hypertension，2001，37(2 Part 2):703-709.

[3]Fraga-Silva R A，Pinheiro S V，Goncalves A C，et al.The antithrombotic effect of angiotensin 1-7 involves mas-mediated NO release from platelets[J].Mol Med，2008，14(1-2):28-35.

[4]Li L，Yi-Ming W，Li Z Z，et al.Local RAS and inflammatory factors are involved in cardiovascular hypertrophy in spontaneously hypertensive rats[J].Pharmacol Res，2008，58(3-4):196-201.

[5]Burrell LM，Risvanis J，Kubota E，et al.Myocardial infarction increases ACE2 expression in rat and humans[J].Eur Heart J，2005，26(4):369-375.