李宏杰，要瑞麗，武慧麗，李常穎，王世鑫

(1.華北煤炭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部病理生理教研室，唐山 063000;2.唐山市職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)部，唐山 063004;3.武警醫(yī)學(xué)院天津市職業(yè)與環(huán)境危害生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300162)

休克是各種強(qiáng)烈致病因子作用于機(jī)體引起的急性循環(huán)衰竭，其特點(diǎn)是微循環(huán)障礙、重要臟器的灌流障礙及細(xì)胞與器官功能代謝障礙，由此引起的全身性危重的病理過(guò)程，是引起器官衰竭和死亡的主要原因之一。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)休克的研究多采生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用提出假設(shè)-驗(yàn)證假設(shè)的模式，對(duì)休克機(jī)制的研究著眼于某一方面，有一定的局限性，而休克作為一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，難以用任何單一機(jī)制來(lái)解釋。

蛋白質(zhì)組的定義為“一種細(xì)胞、組織或完整的生物體所擁有的全套蛋白質(zhì)”[1]，因此，蛋白質(zhì)組是一個(gè)在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整體。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化蛋白質(zhì)的組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成與調(diào)控的活動(dòng)規(guī)律的一門(mén)新興學(xué)科。蛋白質(zhì)組學(xué)能在不預(yù)設(shè)指標(biāo)情況下，對(duì)參與生理和疾病過(guò)程的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。本文通過(guò)建立家兔腸系膜上動(dòng)脈閉塞性(superior mesenteric artery occlusion，SMAO)休克模型，采用了血清比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，觀察SMAO休克前后血清蛋白質(zhì)組學(xué)變化，為SMAO休克的研究提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要儀器

固相pH 梯度膠條(IPG strip pH 4～7)，尿素、硫脲、CHAPS、二硫蘇糖醇(DTT)、兩性電解質(zhì)(Biolyte3-10)、碘乙酰胺(IAA)、三丁基磷(TBP)、TEMED、過(guò)硫酸氨、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、SDS、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、蛋白定量試劑盒(RC DC protein assay kits)及去除血清高豐度蛋白試劑盒(Aurum serum protein mini kits)均為Bio-Rad公司產(chǎn)品;甘油、溴酚藍(lán)、低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自Sigma公司，硝酸銀、碳酸鈉、醋酸鈉、無(wú)水硫代硫酸鈉購(gòu)自上海BBI公司;丙酮、甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、鹽酸為國(guó)產(chǎn)分析純。等電聚焦儀(Protein IEF cell)、垂直電泳系統(tǒng)(ProteinⅡxi Cell)、CHemiDOC XRS凝膠成像系統(tǒng)、PDQuest 7.42 D凝膠圖像分析軟件均購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 家兔SMAO休克模型的復(fù)制及血清標(biāo)本制備

健康家兔10只，體重為(2.5±0.2)kg，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，20%烏拉坦(1 g/kg bw)耳緣靜脈麻醉，分離頸外靜脈并插管用以取血，分離頸總動(dòng)脈并插管，連壓力換能器，接BL-420生理記錄儀(成都泰盟)用以測(cè)量平均動(dòng)脈血壓(mean arterial pressure，MAP)。行腹部手術(shù)分離腸系膜上動(dòng)脈，采用夾閉腸系膜上動(dòng)脈2 h，松夾再灌2 h的方法[2]復(fù)制SMAO休克模型，以再灌后MAP低于夾閉前三分之一作為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)頸外靜脈于缺血前和再灌2 h后各取血5 ml。將血液室溫下靜置2 h ，3500r/min 離心 5 min，取上清液 100μl 分裝 ，-20℃凍存，用于雙向電泳。

1.3 雙向電泳樣品制備[3]

按Aurum serum protein mini kits(Bio-Rad，美國(guó))說(shuō)明去除血清高豐度蛋白，每組50μl混合血清最終得到400μl含低豐度蛋白的洗脫液。將洗脫液與-20℃預(yù)冷的丙酮按體積比1∶3混合，-20℃孵育過(guò)夜，15000×g，4℃離心5 min，沉淀用冷丙酮洗兩次，室溫晾干。加入水化上樣液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲 ，4%CHAPS，65 mmol/L DTT ，0.2%Biolyte3-10)300μl使沉淀中的蛋白充分溶解 ，15000×g、4 ℃離心5 min，取上清液按 RC DC protein assay kits(Bio-Rad，美國(guó))操作手冊(cè)進(jìn)行蛋白定量，以確定上樣量。取蛋白樣品 400μg 用水化上樣液補(bǔ)足體積至 330μl，上樣前臨時(shí)加痕量溴酚藍(lán)及TBP 8μl，室溫孵育40min，再加濃度為 15 mmol/L 的 IAA 溶液 12μl，室溫孵育40min進(jìn)行還原烷基化。

1.4 雙向電泳

雙向電泳按Bio-Rad雙向電泳操作手冊(cè)及我們優(yōu)化好的方案[3]進(jìn)行:第一向等電聚焦，采用17 cm，pH 4～7線性IPG strip。等電聚焦程序:被動(dòng)水化12 h;除鹽 150V 3 h ，250V l h ，500V l h ，2000V l h，5000V l h;升壓10000V 3 h;聚焦達(dá)到60000Vh;500V維持l h。等電聚焦后，將膠條從電泳槽中取出，用潤(rùn)濕的濾紙吸掉膠條上多余的礦物油。分別在平衡液Ⅰ〔0.375 mol/LTris-HCL(pH 8.8)，6 mol/L尿素，20%甘油，2%SDS，20g/L DTT〕和平衡液Ⅱ〔0.375mol/LTris-HCL(pH 8.8)，6 mol/L尿素，20%甘油，2%SDS，25 g/L IAA〕中各平衡15 min。將平衡后的IPG膠條置于12%的均勻SDS聚丙烯酰胺凝膠上方，0.5%低溶點(diǎn)瓊脂糖封閉。電泳參數(shù)為:12 mA/gel 0.5 h，30mA/gel 4.5 h直至溴酚藍(lán)前沿抵達(dá)距膠底邊緣約0.5 cm時(shí)為止。

1.5 染色

凝膠采用與質(zhì)譜兼容的硝酸銀染色方法[4]。電泳后將凝膠浸泡在固定液(25 ml乙酸，100ml乙醇，125 ml超純水)中60min，將凝膠浸泡在敏化液(75 ml乙醇，0.8 g無(wú)水硫代硫酸鈉，17 g醋酸鈉，165 ml超純水)中 30min，超純水洗3次，每次 5 min，將凝膠在硝酸銀溶液(0.625 g硝酸銀，超純水加至250ml)中放置20min，超純水洗2次，每次1 min，接著在顯色液(6.25 g碳酸鈉，100μl甲醛 ，超純水加至250ml)中放置2～10min，將凝膠放在終止液(5%乙酸)中終止反應(yīng)，用超純水洗3次，每次5 min。

1.6 圖像分析

上述樣品制備方法所獲得的蛋白樣品，在相同條件、相同參數(shù)設(shè)置下分別進(jìn)行雙向電泳，每個(gè)樣品重復(fù)3次，凝膠用CHemiDOC XRS凝膠成像系統(tǒng)成像后，PDQuest 8.02D凝膠圖像分析軟件進(jìn)行強(qiáng)度校正、點(diǎn)檢測(cè)、數(shù)目統(tǒng)計(jì)、凝膠匹配等處理。組間比較采用定性分析模式，即所選取的差異點(diǎn)只出現(xiàn)在某一組的凝膠上(匹配點(diǎn)相對(duì)含量的比值大于10者認(rèn)為存在差異)。

1.7 MALDI-TOF-TOF-MS鑒定

將凝膠上最明顯的4個(gè)差異蛋白點(diǎn)分別進(jìn)行切割、脫色及胰酶膠內(nèi)酶解，酶解后的混合物用0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)+50%乙睛(ACN)提取肽段 2 次 ，每次 10min，35μl;氮?dú)獯蹈桑苡?0μl 0.1%TFA水溶液中。使用芥子酸(SA)作為基質(zhì)，基質(zhì)與樣本以 1∶1體積混合 ，取 0.5-1μl加到不銹鋼樣品靶上，在空氣中放置幾分鐘，待溶劑揮發(fā)干后將樣品靶送入ABI 4700質(zhì)譜儀。質(zhì)譜儀條件為紫外激光波長(zhǎng)355 nm，循環(huán)率200Hz，加速電壓20kV，質(zhì)量分辨率1500Da，質(zhì)量范圍700到4000m/z，以基質(zhì)峰和胰酶自動(dòng)降解離子峰作為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜峰。

1.8 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

所獲得圖譜使用ABI公司的GPS軟件檢索，以MASCOT為搜索引擎，在NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索，鑒定蛋白質(zhì)。查詢條件:肽質(zhì)量指紋圖中的肽片段質(zhì)量控制在700～4000，肽片段分子量最大容許誤差控制在±0.1 Da。酶解片段不完全選擇為1個(gè)，離子選擇[M+H]和AVERAGE。最少匹配肽片段數(shù)規(guī)定為5，mass tolerance 0.2 Da，MS/MS tolerance 0.6 Da，對(duì)于一級(jí)質(zhì)譜中相對(duì)豐度較高的前5個(gè)肽段進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列。

2 結(jié)果

2.1 雙向電泳圖譜及分析

2-DE圖譜蛋白點(diǎn)清晰，分辨率高，重復(fù)性好，組內(nèi)匹配率達(dá)到80%以上。用PDQuest 8.02D凝膠圖像分析軟件檢測(cè)到蛋白點(diǎn)數(shù)目分別為MODS前345±11個(gè)，MODS后363±8個(gè)。對(duì)2組膠圖進(jìn)行數(shù)字圖像分析并結(jié)合肉眼比對(duì)，發(fā)現(xiàn)8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)明顯見(jiàn)于MODS前的血清2-DE圖中，而MODS后血清2-DE圖中未見(jiàn)(圖1A)，差異點(diǎn)標(biāo)號(hào)為1-8;而11個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)明顯只見(jiàn)于MODS后血清2-DE圖中，而在MODS前血清2-DE圖中未見(jiàn)(圖1B)，差異點(diǎn)標(biāo)號(hào)為9-19。

Fig.1 2-DE map of serum proteomics in rabbit

2.2 差異蛋白點(diǎn)的串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果及MASCOT數(shù)據(jù)庫(kù)搜索

選取差異最明顯的第2、9、10、18四個(gè)差異蛋白點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜分析獲得4個(gè)蛋白點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜，采用Mascot檢索引擎在NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，鑒定差異蛋白的氨基酸序列，僅接受匹配片段數(shù)＞5且Mascot分值＞81(P＜0.05)的結(jié)果。其中第9和第10蛋白點(diǎn)被鑒定為對(duì)氧磷酶和觸珠蛋白，均在SMAO休克后血清中含量增高;第2和第18蛋白點(diǎn)在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有檢索到與之相匹配的蛋白，可能是新蛋白，有待于進(jìn)一步研究。鑒定后的數(shù)據(jù)庫(kù)序列號(hào)(Accession Number)、Mascot分值(Mascot Score)、等電點(diǎn)(isoelectric point，PI)、分子量(molecularweight，MW)、匹配肽段數(shù)(Peptidesmatched)、蛋白名稱(Protein Name)(表1)。

Tab.1 Differential expressed proteins identified by MAILD-TOF-TOF-MS

3 討論

SMAO休克是腸系膜上動(dòng)脈閉塞引起腸道缺血、恢復(fù)血液再灌注后導(dǎo)致的嚴(yán)重病理過(guò)程[5]。腸缺血/再灌注(ischemia/ruperfusion，I/R)可引起腸道屏障功能障礙，導(dǎo)致腸內(nèi)細(xì)菌毒素移位，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，甚至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，導(dǎo)致危重患者死亡。腸系膜上動(dòng)脈夾閉法復(fù)制的SMAO休克動(dòng)物模型是經(jīng)典的休克動(dòng)物模型，可以較好地模擬休克晚期機(jī)體的功能代謝變化。

本研究發(fā)現(xiàn)，家兔SMAO休克前后的血清蛋白質(zhì)組發(fā)生明顯變化，有8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)只見(jiàn)于MODS前的血清2-DE圖中，11個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)只見(jiàn)于MODS后血清2-DE圖中。在MODS后的血清差異點(diǎn)中，鑒定出符合條件的2個(gè)差異蛋白點(diǎn)，為對(duì)氧磷酶和觸珠蛋白，均在SMAO休克后血清中含量增高。

對(duì)氧磷酶(paraoxonase，PON)是一類能催化水解磷酸酯鍵的芳香酯酶，主要由肝臟分泌，在血清中主要與高密度脂蛋白結(jié)合。PON可降解有機(jī)磷酸酯、芳香羧酸酯及氨基甲酸酯等，對(duì)有機(jī)磷中毒患者有保護(hù)作用;PON還可減少過(guò)量過(guò)氧化物、氧化型磷脂的生成，具有降低動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生率、減少和減輕心腦血管疾病發(fā)生的作用[6];此外PON還具有抗炎活性[7]。因此在本研究中家兔在SMAO休克后血清中PON含量增高，可能通過(guò)它的抗氧化及抗炎活性，發(fā)揮一定的保護(hù)作用。

觸珠蛋白(haptoglobin，Hp)又叫結(jié)合珠蛋白，是血清α 2球蛋白組分中的一種酸性糖蛋白，主要由肝臟合成，也可在脂肪細(xì)胞、皮膚、脾、肌肉、肺內(nèi)等合成，廣泛分布于人及其他哺乳動(dòng)物體液中。結(jié)合珠蛋白作為一種急性期蛋白，在參與宿主抗感染、損傷組織的修復(fù)以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過(guò)程中起著重要作用，其血清含量在感染、創(chuàng)傷、炎癥、心肌梗死等病理狀態(tài)時(shí)顯著升高[8]。在本研究中家兔在SMAO休克后血清Hp含量增高，可能是由于急性期反應(yīng)促進(jìn)肝臟合成Hp，通過(guò)它的抗氧化，抗菌，抑制血管擴(kuò)張，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡的功能可減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)，對(duì)發(fā)生了SMAO休克的機(jī)體起到代償性保護(hù)作用。

本研究由于采用了硝酸銀染色法，而銀染顯色的蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)酶解處理后所含的鹽分及其他非蛋白質(zhì)成分過(guò)高，質(zhì)譜分析時(shí)信噪比低，從而降低肽指紋圖譜分析的靈敏度，影響分析結(jié)果，再加上部分蛋白點(diǎn)豐度較低，本實(shí)驗(yàn)中，送檢的差異蛋白鑒定成功率僅為50%。我們將在今后的研究中進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，如加大上樣量、使用鑒定率較高的考染等，發(fā)現(xiàn)和鑒定出更多的與SMAO休克機(jī)制相關(guān)的差異蛋白。

[1]Reynolds T.For proteomics research，a new race has begun[J].J Natl Cancer Inst，2002，94(8):552-554.

[2]景友玲，趙春秀，段國(guó)賢，等.硫酸鋅對(duì)腸系膜上動(dòng)脈閉塞性休克后肺損傷的治療作用[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2006，22(1):90-93.

[3]要瑞麗，張明順，李宏杰，等.家兔血清蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳技術(shù)的建立[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13(28):5440-5443.

[4]G ?rg A，Obermaier C，Boguth G，et al.The current state of twodimensional eleetrophoresis with immobilized pH gradient[J].Electrophoresis，2000，21(6):1037-1053.

[5]張春暉，牛春雨，趙自剛，等.腸淋巴再灌注對(duì)腸系膜上動(dòng)脈閉塞性休克多器官損傷的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2008，24(11):2103-2107.

[6]Khersonsky O，Tawfik D S.Structure-reactivity studies of serum paraoxonase PON1 suggest that its native activity islactonase[J].Biochem，2005，44(16):6371-6382.

[7]Rozenberg O，Shih DM，Aviram M.Paraoxonase 1(PON1)attenuates macrophage oxidative status:studies in PON1 transfected cells and in PON1 transgenic mice[J].Atherosclerosis，2005，181(1):9-18.

[8]Arredouani M S，Kasran A，Vanoirbeek J A，et al.Haptoglobin dampens endotoxin-induced inflammatory effects both in vitro and in vivo[J].Immunol，2005，114(2):263-271.