蘇 方，張 培，姜治偉，彭德清，高璐瀅，劉書琴，錢令波，葉治國，夏 強(qiáng)

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，杭州 310058)

缺血性腦血管疾病已成為威脅人類健康的三大殺手之一，其在中國的死亡率已居各種疾病之首。我國每年新發(fā)完全性腦中風(fēng)約200萬人，死亡者約150萬人，600～700萬腦中風(fēng)幸存者中50～70%遺留癱瘓、失語等嚴(yán)重殘疾，需要醫(yī)療照顧者300余萬，給患者家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。及時(shí)恢復(fù)缺血區(qū)域的血液灌流是減小腦缺血梗死面積、減少病死率和致殘率的最有效辦法，然而臨床和實(shí)驗(yàn)研究均發(fā)現(xiàn)缺血區(qū)恢復(fù)血液灌流后缺血損傷進(jìn)一步加重，即存在腦缺血/再灌注損傷[1]。由于腦缺血/再灌注損傷機(jī)制復(fù)雜，臨床上至今尚未有效對策減少這種損傷，研究表明自噬可以被急性缺血誘導(dǎo)，在維持缺血缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞存活中有重要意[2]。但是自噬在腦缺血/再灌注過程中起保護(hù)作用還是損傷作用，至今仍不明確。本實(shí)驗(yàn)以對腦缺血損傷敏感的海馬神經(jīng)元為研究對象[3]，通過檢測神經(jīng)元在缺血缺氧/再灌注不同階段自噬的表達(dá)，探討自噬在神經(jīng)元缺血缺氧/再灌注過程中的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與溶液

3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，多聚-D-賴氨酸，3-甲基腺嘌呤(3-MA)為Sigma公司產(chǎn)品。Neurobasal Medium A，B27，L-谷氨酸，DMEM高糖培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品。LC3B為Cell Signaling公司產(chǎn)品。其余試劑均為市售分析純，其中0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，mmol/L):NaCl 136.75 ，KCl 2.68 ，Na2HPO44.02 ，KH2P041.76 ，pH 7.4。

1.2 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)

出生24h內(nèi)的SD大鼠由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，經(jīng)乙醇消毒后斷頭取腦，無菌條件下急性分離海馬組織并去除腦膜和血管，在0.25%的胰酶中37℃消化20min。終止消化后，依次進(jìn)行3次機(jī)械吹打以分離細(xì)胞，分別收集細(xì)胞懸液離心沉淀，再把細(xì)胞重懸于含20%體積分?jǐn)?shù)的B27，青霉素鏈霉素雙抗和0.2 mmol/L L-谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)基中，并于培養(yǎng)初期添加L-谷氨酸至終濃度為 0.2 mmol/L，然后種植在預(yù)先用多聚-D-賴氨酸包被過的24孔培養(yǎng)板中或玻璃片上。置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)(Thermo公司，美國)，每隔3 d進(jìn)行半量換液，培養(yǎng)10d后的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 神經(jīng)元氧糖剝奪/再灌注

將培養(yǎng)基換為預(yù)先通以無氧混合氣體(95%N2+5%CO2)30min的無糖培養(yǎng)液(mmol/L):NaCl 137，KCl 5.4，CaCl21.8 ，MgSO40.8 ，HEPES 10，pH 7.4。然后將細(xì)胞立即置于通有無氧混合氣體的密閉容器中，37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)2 h。正常對照組細(xì)胞的培養(yǎng)液則換成添加5 mmol/L葡萄糖的細(xì)胞外液后置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在達(dá)到設(shè)定的神經(jīng)元氧糖剝奪/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)時(shí)間后，把細(xì)胞外液換回Neurobasal培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)需要，3-MA用PBS溶解，于氧糖剝奪前1 h加入，使3-MA終濃度為5 mmol/L。

1.4 細(xì)胞存活度檢測

OGD/R結(jié)束后，在培養(yǎng)孔中加入0.5 mg/ml的MTT與神經(jīng)元在37℃共同孵育4h，棄上清后每孔加入400μl的二甲基亞砜溶解甲瓚，利用酶標(biāo)儀(Tecan公司，瑞士)在490nm波長下測定甲瓚的吸光度值，以此反映細(xì)胞存活度。以正常對照組的細(xì)胞存活度為100%，OGD/R組細(xì)胞存活度(%)=OGD/R組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.5 自噬體檢測

OGD/R處理后的細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化液消化，待光鏡下見細(xì)胞回縮，胞體變圓，細(xì)胞間隙變大時(shí)，立即加入胎牛血清終止消化，經(jīng)1000r/min×10min離心沉淀，收集細(xì)胞于離心管內(nèi)，棄上清后，用2.5%戊二醛4℃固定。固定后的細(xì)胞用0.1 mol/L PBS沖洗兩次，每次15 min，1%鋨酸4℃后固定1 h。0.1 mol/L PBS沖洗兩次，每次15 min，2%醋酸鈾水溶液染色30min，50%、70%、90%酒精依次脫水各15 min，100%酒精脫水20min，100%丙酮脫水20min兩次。滲透無水丙酮與包埋劑按1∶1體積混合滲透組織并振蕩2 h，純包埋劑滲透組織并振蕩1.5～2 h，純包埋劑包埋，并置于37℃烘箱內(nèi)聚合24h。超薄切片用銅網(wǎng)固定，用PHILIPS2 TECNA I 10透射電鏡80kV觀察并照相。

1.6 LC3B表達(dá)檢測

大鼠海馬神經(jīng)元經(jīng)氧糖剝奪/再灌注處理后，于蓋玻片上用冰甲醇(-20℃)固定細(xì)胞5 min，固定的細(xì)胞用PBS沖洗兩次后，加入0.25%Triton-X 100，冰上放置5 min，PBS沖洗2次，然后加入5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)處理30min，加入1%BSA稀釋的兔抗鼠MAP1-LC3B(1∶200)，4℃孵育過夜，次日用PBS沖洗3次后，加入TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(0.01 mol/L PBS以1∶200的比例稀釋)，室溫下避光孵育2 h，PBS再次洗滌細(xì)胞后，用5μg/ml DAPI室溫下細(xì)胞核DNA染色 30min，熒光顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)下觀察LC3B的表達(dá)。

1.7 自噬抑制劑的作用

3-MA用PBS溶解，儲存濃度為100mmol/L，其冷卻時(shí)有沉淀，使用前加熱使之溶解。于氧糖剝奪前1 h加入，使3-MA終濃度為5 mmol/L。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 OGD/R對神經(jīng)元存活率的影響

與正常對照組相比，培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元經(jīng)OGD/R處理后，細(xì)胞存活率顯著降低(P＜0.05)。自噬抑制劑3-MA(5 mmol/L)對正常對照神經(jīng)元的細(xì)胞存活率影響甚微，在OGD前1 h用3-MA處理細(xì)胞，神經(jīng)元的死亡率與對照組相比均有不同程度的增加，且都具有顯著性差異(P＜0.05，圖1B)。表明OGD/R處理對神經(jīng)元有損傷作用，而自噬則可能起到對抗此損傷的作用(圖1，表1)。

2.2 OGD/R對海馬神經(jīng)元自噬的影響

OGD 2 h的神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)即出現(xiàn)雙層膜的自噬體結(jié)構(gòu)，分別經(jīng)再灌注不同時(shí)間的神經(jīng)元胞質(zhì)中也充滿了自噬泡，其內(nèi)含有變性的胞質(zhì)成分及被消化降解后形成的髓鞘樣結(jié)構(gòu)(圖2)。表明OGD/R處理誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。

Fig.1 Effect of OGD/R on rat hippocampal neurons viability without 3-MA(A)and pretreated with 3-MA(B)(，n=8)

Fig.2 Autophagosomes in OGD/R treated rat hippocampal neurons during different reperfusion time detected by transmission electronic microscopy(×6.2 k).

Tab.1 Effects of OGD/R on rats hippocampal neurons viability without 3-MA and pretreated with 3-MA(，n=8)

Tab.1 Effects of OGD/R on rats hippocampal neurons viability without 3-MA and pretreated with 3-MA(，n=8)

*P＜0.05 vs control

Group Control R 0h R 2 h R 4h R 6 h R 12 h R 24h R 48 h 3-MA(-)(%) 100±066.04±0.02*66.51±0.02*65.98±0.01*68.15±0.02*79.74±0.03*70.01±0.02*88.87±0.02*3-MA(+)(%)100±052.87±0.02*43.51±0.01*38.27±0.01*37.58±0.02*44.85±0.02*45.12±0.02*39.46±0.03*

2.3 OGD/R對海馬神經(jīng)元自噬特異性蛋白LC3B的影響

在熒光顯微鏡下，經(jīng)紅色熒光TRITC標(biāo)記的自噬特異性蛋白LC3B在OGD期間就已經(jīng)存在(圖3)。LC3B紅色熒光呈點(diǎn)狀散在分布于細(xì)胞膜附近，此變化一直持續(xù)到再灌注48 h，而對照組只有極弱的熒光。再灌注0h至48 h各組LC3B熒光陽性細(xì)胞數(shù)與對照組相比均有顯著增加，且都具有顯著性差異(P＜0.05，圖4)。但再灌注各組間無顯著性差異。表明OGD/R處理誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生，且在再灌注的0h至48 h時(shí)間段中，自噬呈持續(xù)性高度發(fā)生。

3 討論

缺血性腦中風(fēng)是臨床常見病、多發(fā)病，死亡率及致殘率極高，缺血缺氧/再灌注損傷涉及極其復(fù)雜的病理生理過程，其中各個(gè)環(huán)節(jié)、各種影響因素的相互作用尚未完全闡明，研究此類疾病的機(jī)制具有重要的臨床意義。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能單位，是腦缺血損傷保護(hù)的核心所在。氧糖缺乏是腦缺血產(chǎn)生損傷的兩個(gè)基本因素，腦細(xì)胞的損害在本質(zhì)上主要是腦組織氧糖缺乏而引起的一系列事件的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)用體外氧糖剝奪/再灌注模型來模擬體內(nèi)缺血/再灌注損傷。結(jié)果顯示大鼠海馬神經(jīng)元氧糖剝奪處理2 h后，再灌注過程中細(xì)胞活力明顯降低。

Fig.3 LC3B(red fluorescense)in OGD/R treated rat hippocampal neurons during different reperfusion time detected by immunofluorescense microscopy

Fig.4 LC3B fluorescense cell rate in OGD/R treated rat hippocampal neurons during different reperfusion time(，n=8)

細(xì)胞死亡是指細(xì)胞生命活動的終止與消亡。在多細(xì)胞生物中，一直認(rèn)為細(xì)胞死亡有兩種不同的形式，一種是細(xì)胞壞死，它是由于某些外界因素，如局部貧血、物理化學(xué)損傷或生物的侵襲等造成細(xì)胞急速死亡;另一種稱為程序性細(xì)胞死亡，凋亡只是程序性細(xì)胞死亡的方式之一，自噬被稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[4]。自噬既廣泛存在于正常的生理過程中，如清除細(xì)胞廢物、結(jié)構(gòu)重建、生長分化等，又是細(xì)胞對不良環(huán)境的一種防御機(jī)制，如對抗?fàn)I養(yǎng)缺乏、電離輻射，同時(shí)還參與多種疾病的病理過程，無論是自噬過度還是自噬不足都可能導(dǎo)致疾病發(fā)生。自噬現(xiàn)象最早是由電鏡觀察發(fā)現(xiàn)的，迄今為止，電鏡也是檢測自噬最可靠的方法[5]。自噬主要包括4個(gè)環(huán)節(jié)，即底物誘導(dǎo)自噬前體的形成、自噬體形成、自噬體與溶酶體融合和自噬體內(nèi)容物被降解[6]。自噬在不同的發(fā)生階段具有其形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。自噬起始時(shí)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)許多游離雙層膜結(jié)構(gòu)，并逐漸形成杯狀凹陷，這些結(jié)構(gòu)稱為自噬前體。自噬前體逐漸延伸，包裹細(xì)胞質(zhì)或損傷的細(xì)胞器形成泡狀結(jié)構(gòu)，稱為自噬體。自噬體膜的來源還不十分清楚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體內(nèi)膜和外膜等多種來源的膜結(jié)構(gòu)均為自噬體的形成提供了脂質(zhì)[7]。自噬體多位于細(xì)胞核周圍以及線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近。自噬體的外膜與溶酶體膜融合，內(nèi)膜及其所包裹的物質(zhì)進(jìn)入溶酶體腔，形成自噬溶酶體。自噬溶酶體多呈圓形，內(nèi)含單層膜包被的自噬體。進(jìn)入溶酶體中的底物被降解后，所生成的脂肪酸和氨基酸可被重新用于細(xì)胞的能量代謝和蛋白質(zhì)合成[8]。本實(shí)驗(yàn)用透射電鏡方法檢測證實(shí)了缺血缺氧/再灌注后自噬體的形成，是自噬被激活的直接證據(jù)。微管相關(guān)蛋白質(zhì)1輕鏈(3MAP1-LC3)是哺乳動物自噬體形成相關(guān)蛋白，在自噬過程中經(jīng)過翻譯后修飾形成三種 LC3同工型:LC3A，LC3B和LC3C[9]。本實(shí)驗(yàn)中我們用LC3B這個(gè)自噬標(biāo)記物，進(jìn)一步證實(shí)了缺血缺氧/再灌注后自噬體的形成，自噬被激活。由免疫熒光結(jié)果可以看出，在正常狀態(tài)下自噬的發(fā)生率非常低，缺血處理及缺血/再灌注處理均能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。在本實(shí)驗(yàn)中，從缺血結(jié)束到再灌注48h均有大量細(xì)胞發(fā)生自噬。這是細(xì)胞對外界損傷的一種反應(yīng)。3-甲基腺嘌呤(3-MA)是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的抑制劑，可促進(jìn)溶酶體堿化，導(dǎo)致自噬體不能與溶酶體融合而特異性阻斷自噬的發(fā)生[10]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用3-MA后缺血缺氧/再灌注的各組神經(jīng)元存活率均顯著下降，由此推斷自噬可能在缺血/再灌注過程中對神經(jīng)元有保護(hù)作用。并可以推斷PI3K/PKB通路在自噬過程中發(fā)揮作用，其調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

在缺血缺氧/再灌注應(yīng)激情況下，細(xì)胞啟動自噬機(jī)制來清除受損線粒體，避免凋亡因子釋放進(jìn)入胞質(zhì)，同時(shí)提高細(xì)胞對低氧的耐受力，對細(xì)胞起到一定保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，在神經(jīng)元缺血缺氧/再灌注后自噬被激活并可能對受損的細(xì)胞起保護(hù)作用。但自噬是否會導(dǎo)致缺血缺氧/再灌注神經(jīng)元的自噬性程序性死亡，及自噬性程序性死亡與凋亡及壞死的關(guān)系，仍有待于進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在臨床治療缺血性腦中風(fēng)過程中，要充分考慮細(xì)胞自噬的存在，充分發(fā)揮自噬對細(xì)胞存活有利的一面，以提高對缺血性腦中風(fēng)的治療手段。

[1]Bates B，Hirt L，Thomas S S，et al.Neurotrophin-3 promotes cell death induced in cerebral ischemia，oxygen-glucose deprivation，and oxidative stress:possible involvement of oxygenfree radicals[J].Neurobiol Dis，2002，9(1):24-37.

[2]Young A R，Chan E Y，Hu X W，et al.Starvation and ULK1-dependent cycling of mammalian Atg9 between the TGN and endosomes[J].J Cell Sci，2006，119(Pt18):3888-3900.

[3]劉紅梅，佟振清，張敬東，等.大鼠全腦缺血后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞DND的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國應(yīng)用生理生理學(xué)雜志，1998，14(3):201-204.

[4]Levine B，Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of di-sease[J].Cell，2008，132(1):27-42.

[5]Mizushima N:Methods for monitoring autophagy[J].Int J Biochem CellBiol，2004，36(12):2491-2502.

[6]Reggiori F，Wang C W，Nair U，et al.Early stages of the secretory pathway，but not endosomes，are required for Cvt vesicle and autophagosome assembly in Saccharomyces cerevisiae[J].MolBiol Cell，2004，15(5):2189-2204.

[7]Juhasz G，Neufeld T P.Autophagy:a forty-year search for a missing membrane source[J].PLoS Biol，2006，4(2):e36.

[8]VenugopalB，MesiresN T，Kennedy J C，et al.Chaperonemediated autophagy is defective inmucolipidosis type IV[J].J Cell Physiol，2009，219(2):344-353.

[9]Kabeya Y，Mizushima N，Ueno T，et al.LC3，a mammalian homologue of yeast Apg8p，is localized in autophagosome membranes after processing[J].EMBO J，2000，19(21):5720-5728.

[10]Blommaart E F，Krause U，Schellens J P，et al.The phosphatidylinositol 3-kinase inhibitorswortmannin and LY294002 inhibit autophagy in isolated rat hepatocytes[J].Eur J Biochem，1997，243(1-2):240-246.