張元元，段瑞峰，汪 海

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所心血管管物研究中心，北京 100850)

高原腦水腫是一種嚴重的高原地區(qū)特發(fā)病，發(fā)病急、病情重。機體快速暴露于高原低氧環(huán)境后，因機體缺氧導(dǎo)致腦循環(huán)嚴重障礙而產(chǎn)生腦細胞水腫，產(chǎn)生嚴重的腦功能障礙和意識喪失，某些病例可并發(fā)肺水腫。高原腦水腫的發(fā)病主要因素是急性高原低氧暴露、勞累、寒冷、呼吸道感染、精神劇變等，個人的易感性也是高原腦水腫發(fā)病的重要因素[1]。高原腦水腫的發(fā)病機制尚不十分清楚。一般認為高原低氧暴露導(dǎo)致血氧分壓下降，造成腦細胞腫脹及血管內(nèi)液外滲。腦細胞代謝障礙，能量供應(yīng)不足，細胞膜鈉-鉀泵功能失常，鈉與水進入細胞內(nèi)造成細胞腫脹、細胞外間隙減少;腦微血管內(nèi)皮細胞受損，微血管通透性增加，液體滲出;腦血管擴張和腦血流量增加，腦循環(huán)內(nèi)流體靜脈壓升高，引起液體外滲。高原腦水腫形成后，若進一步發(fā)展，使顱內(nèi)壓升高可壓迫血管，腦血管受壓以及血管內(nèi)皮細胞腫脹均可影響腦血液循環(huán)，從而加重腦的缺氧，形成惡性循環(huán)[2]。

目前高原腦水腫發(fā)病機制仍然不清楚，對高原腦水腫易感者的早期預(yù)測和診斷缺乏有效的生化指標。因此研究腦水腫發(fā)病的分子機制、尋找疾病診斷標志物具有重要意義。近年蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為研究疾病發(fā)病機制、尋找適宜的生物標志物提供了可能[3]。本實驗首次將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于高原腦水腫分子機制的研究中，采用蛋白質(zhì)組學(xué)經(jīng)典技術(shù)二維雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)探討了一例高原腦水腫患者與高原肺水腫和急性高原反應(yīng)患者血漿蛋白表達的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)載脂蛋白 E(apolipoprotein E，apo E)表達均發(fā)生變化。該蛋白的發(fā)現(xiàn)對于研究高原腦水腫發(fā)病分子機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

人員急進海拔4000m左右玉樹地區(qū)執(zhí)行任務(wù)時，一例發(fā)生高原肺水腫并發(fā)腦水腫(high-altitude cerebral edema，HACE)，另選高原肺水腫(high-altitude pulmonary edema，HAPE)和急性高原反應(yīng)(mild acute mountain sickness，mAMS)血漿樣本各一例與高原肺水腫并發(fā)腦水腫進行血漿蛋白質(zhì)組分析(表1)。取研究對象發(fā)病后七日內(nèi)靜脈血5 ml，肝素鈉抗凝，室溫放置 15 min，2000r/min 離心10min，吸取上層血漿，保存于-70℃冰箱備用。

Tab.1 Characteristics of plasma sample used for 2D in this study()

Tab.1 Characteristics of plasma sample used for 2D in this study()

Group Age Nation Sex Altitude/(m) Go to high altitude Get sick Collect sample mAMS 24 Han Female 3800 2010.4.15 2010.4.17 2010.4.23 HAPE 32 Han Female 3700 2010.4.15 2010.4.18 2010.4.23 HACE 34 Han Female 3788 2010.4.15 2010.4.19 2010.4.23

1.2 試劑和儀器

硫脲、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺、CHAPS、IPG buffer(pH3～10)、固相pH梯度干膠條(IPGstrip pH 4-7，24 cm)、蛋白銀染試劑盒、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、SDS、DNA酶、雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)標準品均購自GE公司;Bradford蛋白定量試劑盒(博邁德);IPGphorⅢ等電聚焦儀、Ettan DALTⅡ垂直平板電泳系統(tǒng)、Image Master 2D Platinum 6.0凝膠圖像分析軟件、Imagescanner掃描儀、Labscan掃描控制和分析前處理軟件為GE公司產(chǎn)品。

1.3 試劑盒去除高豐度蛋白

血漿樣本置于4℃融解，ProteoPrepRBlue Albumin and IgG Depletion Kit(Sigma)去除血漿中白蛋白和免疫球蛋白。70μl平衡緩沖液與30μl原血漿混合后加入平衡好的柱子中，室溫放置10min，其余步驟均按照試劑盒說明書嚴格進行。將去除白蛋白和免疫球蛋白后的血漿收集到樣品管中，結(jié)合在柱子上的白蛋白和免疫球蛋白用試劑盒中Type4試劑洗脫到離心管中。Bradford法測定去除白蛋白和免疫球蛋白后血漿蛋白質(zhì)濃度。

1.4 二維凝膠電泳及染色

第一向等電聚焦電泳:250μg去除白蛋白和免疫球蛋白后的血漿樣本與水化液(7 mol/L urea，2 mol/L thiourea，2%(w/v)CHAPS，0.3%(w/v)DTT，0.5%(v/v)IPG Buffer)混合后總體積為 450μl，4℃放置1 h。將混合液加入標準膠條槽中并放入24 cm，pH 4-7線性IPG干膠條，加入礦物油覆蓋。在Ettan IPGphorⅢ等電聚焦系統(tǒng)上進行IEF電泳，程序設(shè)置如下:30V，12 h;200V，1 h;500V，1 h;1000V～10000V，1 h;10000V，60000Vh到結(jié)束。將等電聚焦后的固相 pH梯度膠條放入15 ml平衡液(1.5 mol/L Tris，6 mol/L 脲，30%甘油，2%SDS ，微量溴酚藍)中，于搖床上震蕩2×15 min。其中，第一種平衡液中含有1%DTT，而第二種平衡液中代之以2.5%碘乙酰胺。

第二向SDS-PAGE:配制10%的均勻SDS-聚丙烯酰胺凝膠，將平衡后的IPG膠條移至凝膠的上方，0.5%低熔點瓊脂糖封膠，上下電泳槽中加入電極緩沖液，初始功率為每塊膠1 W，電泳1 h后改為每塊膠10W直到溴酚藍到達凝膠最底端停止電泳，采用質(zhì)譜兼容的硝酸銀染色法進行染色。用LabScan掃描儀以投射方式、300dpi掃描獲取mell格式的圖像文件。

1.5 差異分析和質(zhì)譜鑒定

將保存的凝膠圖像文件導(dǎo)入ImageMaster 2D Platinum 6.0軟件系統(tǒng)進行分析，主要包括圖像加工、蛋白質(zhì)斑點檢測與定量、凝膠匹配、數(shù)據(jù)分析等過程。1.5 mg蛋白進行雙向凝膠電泳分離后采用熱考馬斯亮蘭染色，將雙向電泳膠上經(jīng)熱考馬斯亮藍染色的斑點用刀片切下，切成1 mm×1 mm的膠塊，置于 Eppendorf管中，用 100μl 50%乙腈/100mmol/L碳酸氫銨洗滌20min重復(fù)2～3次，至脫色干凈。脫色后的膠片置于真空干燥器中干燥20min，然后加入10ng/μl的胰蛋白酶液(25 mmol/L碳酸氫銨溶液，pH 8.0)5～ 10μl，置于4℃冰箱放置40min使膠片完全吸收酶液，再補加10μl 25 mmol/L碳酸氫銨緩沖液，于37℃溫育過夜。用5%TFA 50～100μl于 40℃提取酶切肽段 1 count/h，再用相同體積的50%ACN/2.5%TFA溶液于30℃提取1 count/h，最后用 50μl ACN超聲提取一次，合并 3次提取液，用真空干燥器進行干燥。干燥后的樣品用3-5μl 0.1%的甲酸溶液溶解。而后用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)進行分析。將質(zhì)譜鑒定所得肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting，PMF)數(shù)據(jù)于數(shù)據(jù)庫中查詢，數(shù)據(jù)庫檢索程序根據(jù)輸入的蛋白質(zhì)等電點、分子質(zhì)量范圍及肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)和其他一些參數(shù)在數(shù)據(jù)庫中尋找與這些參數(shù)相匹配的蛋白質(zhì)，檢索數(shù)據(jù)庫為http://www.matrixscience.com。

1.6 ELISA驗證

采用人血液ELISA試劑盒(R&D公司，USA)對apo E進行定量，驗證雙向凝膠電泳結(jié)果。所有操作均按照試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 高原肺水腫并發(fā)腦水腫與高原肺水腫血漿蛋白質(zhì)圖譜比較

對1例高原腦水腫與1例高原肺水腫的血漿蛋白質(zhì)進行二維凝膠電泳分析，每一樣品同時跑6塊雙向電泳凝膠，經(jīng)銀染顯色后采用LabScanner掃描儀掃描獲取圖像，將圖像保存為mell格式，導(dǎo)入ImageMaster 2D Platinum 6.0軟件，對凝膠圖譜進行計算機匹配分析，匹配率＞60%。尋找兩血漿樣品比較中表達豐度差異在2倍以上的蛋白質(zhì)點，發(fā)現(xiàn)高原腦水腫與高原肺水腫比較時，發(fā)生變化的蛋白質(zhì)點有6個，它們在高原腦水腫樣本中表達均下調(diào)(圖1)。

2.2 高原肺水腫并發(fā)腦水腫與急性高原反應(yīng)患者血漿蛋白質(zhì)圖譜比較

用相同方法對1例高原腦水腫與1例急性高原反應(yīng)患者的血漿蛋白質(zhì)進行二維凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)有6個蛋白質(zhì)點發(fā)生變化，在高原腦水腫樣本中點12下調(diào)，其余上調(diào)(圖2)。

2.3 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

切取膠上的12個相應(yīng)的差異蛋白質(zhì)點，經(jīng)膠內(nèi)原位酶解后進行MALDI-TDF-MS測定，選用Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，鑒定各蛋白質(zhì)點(表2)。

Fig.1 Differential expression of proteins from serum samples between the HACE and HAPE.Proteins were separated by 2D PAGE(the first dimension，24 cm，pH 4-7，linear gradient of IPG strips;the second dimension，12.5%SDS-PAGE)and visualized by Silver staining.The numbered arrows indicated corresponding differentially expressed protein spots between the HACE and HAPE

Fig.2 Differential expression of proteins from plasma samples between the HACE and mAMS.Proteins were separated by 2D PAGE(the first dimension，24 cm，pH 4-7，linear gradientof IPG strips;the second dimension，12.5%SDS-PAGE)and visualized by silver staining.The numbered spots indicated corresponding differentially expressed protein spots between the HACE and mAMS

2.4 ELISA檢測載脂蛋白E結(jié)果

ELISA檢測apo E在高原腦水腫、高原肺水腫和急性高原反應(yīng)患者血漿中含量，測得波長450nm條件下A(光密度值)分別為1.523、2.595和0.537，以上結(jié)果驗證了蛋白質(zhì)雙向電泳的結(jié)果。

3 討論

一般認為高原腦水腫是急性高山病的晚期階段，共濟失調(diào)、意識改變?yōu)槠渑R床特征[4]，診斷治療不及時可能發(fā)展為昏迷甚至死亡。高原腦水腫發(fā)病時可見神經(jīng)精神體征方面明顯改變，如劇烈頭痛、嘔吐、表情淡漠、精神抑郁或欣快多語、煩躁不安、共濟失調(diào)等，隨之神智恍惚、意識蒙、嗜睡、昏睡，甚至昏迷等，可出現(xiàn)肢體功能障礙，腦CT和核磁共振提示高原腦水腫與不可逆的腦皮質(zhì)性癡呆有因果關(guān)系[5]。高原肺水腫并發(fā)高原腦水腫患者精神神經(jīng)病學(xué)后遺癥發(fā)生率為21.5%，其中癡呆為21.8%[6]。

二維凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)是一種尋找差異蛋白質(zhì)的高通量的方法，廣泛應(yīng)用于心血管疾病的研究中。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以更有效地在血漿中尋找疾病相關(guān)標志物，為疾病的預(yù)防、診斷及治療提供重要的依據(jù)。本實驗首次將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于高原腦水腫研究中，應(yīng)用二維凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定的技術(shù)，得到可能與高原腦水腫發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示與高原肺水腫、急性高原反應(yīng)發(fā)病者比較，高原腦水腫患者血漿載apo E均發(fā)生變化。

Tab.2 Identification of the eight differentially expressed proteins among HACE and mAMS groups

載脂蛋白E是一種多態(tài)性蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量為37 kDa。apo E主要在肝臟和大腦中合成，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要是腦星形膠質(zhì)細胞，外周神經(jīng)系統(tǒng)則由巨噬細胞參與合成。apo E的主要功能是通過低密度脂蛋白(LDL)受體介導(dǎo)的攝入、極低密度脂蛋白(VLDL)內(nèi)甘油A酯的水解、VLDL分泌及VLDL向LDL的轉(zhuǎn)化等[7]參與機體脂質(zhì)代謝。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中apo E參與神經(jīng)細胞膜修復(fù)、再生長與維持。創(chuàng)傷性腦損傷后，apo E蛋白表達強度在大鼠和人腦中均較對照組有顯著性增強，這表明當中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時，apo E蛋白表達量越多，損傷越重，可能通過轉(zhuǎn)運膽固醇和磷脂到損傷神經(jīng)元內(nèi)促進細胞修復(fù)。apo E基因有三種等位基因形式:ε 2，ε 3和ε 4，ε 3 為最常見的等位基因[8]。諸多研究表明，apo E基因及其多態(tài)性和多種疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。近年來，apo E的不同基因型對心血管病影響已得到公認，而對腦血管病的作用尚存在爭議。在眾多研究中，普遍認同的是ε 2與ε 4等位基因是缺血性腦血管病發(fā)作易感性的遺傳標志。apo E ε 4等位基因不僅與阿爾茨海默病AD的發(fā)病密切相關(guān)，也影響AD的進展和病理過程，其在發(fā)病中的作用機制至今仍不十分清楚，可能通過與β/A4肽結(jié)合而促進其沉積，進而促進老年斑的形成[9]。也有研究發(fā)現(xiàn)，ε 2有明顯的保護性效應(yīng)[10]。有關(guān)apo E多態(tài)性在其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用，觀點也存在分歧，但諸多學(xué)者均認為存在相關(guān)性。本實驗中發(fā)現(xiàn)高原腦水腫并發(fā)肺水腫和高原肺水腫患者血漿中apo E含量明顯高于急性高原反應(yīng)患者，但是高原腦水腫并發(fā)肺水腫患者血漿中apo E含量低于高原肺水腫患者血漿含量這可能與不同個體apo E表達亞型不同，對中樞神經(jīng)發(fā)揮作用不同，而其亞型表達的不同與高原腦水腫發(fā)病的關(guān)系有待進一步的研究。

高原腦水腫患者存在不同程度的精神變化，嚴重者無法完全恢復(fù)，出現(xiàn)癡呆、失語、記憶障礙等后遺癥。apo E與腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有密切的關(guān)系，提示腦內(nèi)脂蛋白代謝紊亂很可能與高原腦水腫發(fā)病時認知功能障礙及后遺癥癡呆的發(fā)生有關(guān)。然而，由于高原腦水腫樣本較少，因此apo E和其它蛋白質(zhì)是否可以作為生物標志物，對疾病的預(yù)防、診斷及治療的意義需要在新的樣本以及后續(xù)的實驗中不斷研究。

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