吳健全，郭長江，高蔚娜，劉 晉，韋京豫，楊繼軍

(軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所，天津 300050)

在運動過程中，機體的工作能力或工作效率下降，不能維持在特定水平上，經(jīng)過適當休息可以恢復的生理現(xiàn)象，稱為運動性疲勞。對于疲勞的研究已逾百年歷史，但疲勞發(fā)生的具體機制目前仍未十分明了。許多假說用來解釋疲勞現(xiàn)象[1]，如代謝物堵塞、能源耗竭、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性失調(diào)、保護性抑制、神經(jīng)-肌肉疲勞控制鏈“突變”理論等。這些學說都曾成功解釋了疲勞某一方面現(xiàn)象，在運動性疲勞及其預防研究中發(fā)揮過一定的作用，但由于疲勞過程涉及骨骼肌、呼吸、循環(huán)、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫等多系統(tǒng)功能，表現(xiàn)為復雜的網(wǎng)絡化調(diào)節(jié)，目前還沒有一種理論能夠完全把握疲勞過程中的各種現(xiàn)象。

代謝組學是一種新興的組學技術，通過測定生物樣品內(nèi)源性代謝產(chǎn)物含量，并采用模式識別方法對機體代謝表型進行分析，高通量、全景式研究生物體在生理、病理等狀況下發(fā)生的各種代謝動態(tài)變化，有助于發(fā)現(xiàn)外來因素對機體發(fā)揮作用的靶器官和位點，確定特異性生物標記物，為作用機制研究提供新的研究方向或思路[2]。

本研究以非耐力訓練小鼠為研究對象，采用一次性負重游泳方式建立疲勞模型，采用代謝組學分析方法研究疲勞過程機體代謝表型變化，從物質和能量代謝角度探討疲勞過程及其機制，為正常人群疲勞干預措施研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性昆明小鼠60只，體質量18～20g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK-(軍)2007-004。

1.2 方法

小鼠按體重隨機分為4組，每組5只。分別為正常對照組和3個運動組，均給予AIN-93合成飼料，喂養(yǎng)14 d。喂養(yǎng)期間小鼠適應性游泳2次，每次10min。第15天運動組小鼠尾部系相當體重2%的鉛絲，置水溫35℃，水深30cm的桶中進行負重游泳試驗，時間分別為30min，60min和120min。游泳后擦干動物體表水分，乙醚麻醉，摘眼球取血，分離血清，-20℃凍存。

1.3 1H NMR分析

離心管中加入 100μl 3-三甲基硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸鈉(TSP，Merck)的重水(D2O，美國Cambridge Isotope Laboratories)溶液(1mg/ml)，150μl血清以及 350μl重水，充分震蕩混勻后，用 Eppendorf MiniSpin Plus型離心機13000r/min離心10min。取550μl上清加入核磁共振管中待用。

在Varian INOVA 600MHz超導核磁共振譜儀(美國Varian)上調(diào)用馳豫編輯(Carr-Purcell-Meiboom-Gill，CPMG)和擴散 編輯(Long-eddy-delay，LED)脈沖序列對樣品進行檢測。CPMG譜寬為8000Hz，采樣點數(shù)32 k，采樣時間2 s，累加次數(shù)128次，其間采用低功率脈沖對水峰進行預飽和。LED譜寬為8000Hz，采樣點數(shù)32 k，采樣時間2 s，累加次數(shù)128次，擴散時間為100ms，其間采用低功率脈沖對水峰進行預飽和。在對自由感應衰減(free induction decay，F(xiàn)ID)信號數(shù)據(jù)進行填零，分別加上0.5 Hz(CPMG實驗)和3 Hz(LED實驗)的線增寬因子后進行傅立葉變換轉得到1H NMR譜圖。以乳酸甲基信號雙峰的左側峰定為δ 1.33。

1.4 數(shù)據(jù)處理

CPMG數(shù)據(jù)和LED數(shù)據(jù)分段積分，將積分按每張譜的總積分強度歸一化。所得數(shù)據(jù)輸出并轉換到Excel文件保存，以SIMCA-P+軟件(v10.04，Umetrics，Umea，Sweden)進行多元統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用平均中心化(mean centering)或Pareto標度化進行預處理之后采用PCA分析。為強化組間差異，進一步采用PLS-DA或OSC分析。分析結果以得分圖(scores plot)和載荷圖(loadings plot)的形式表示。得分圖采用各樣本在前2個主成分坐標中的位置來表示，反映樣本間的分布，從中可以得出樣本之間的差異;載荷圖反映各積分段對樣本主成分得分值的貢獻大小，結合得分圖中組間分布差異，可找出對這種差異貢獻較大的一些積分段;由其對應的化學位移并結合1H NMR譜圖，可確定相應的代謝物，從而對樣品中某些代謝物的變化及其可能意義進行深入分析。

2 結果

2.1 負重游泳后小鼠血清1H NMR圖譜的變化

從小鼠血清CPMG1H NMR譜可看出，小鼠血樣內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物隨游泳時間而發(fā)生變化，各主要波峰的歸屬為β-羥丁酸(1.2)、乳酸(1.31-1.33，4.10-4.12)、乙酸(1.92)、丙酮(2.22)、丙酮酸(2.26)、膽堿(3.20)、磷酸膽堿(3.22，3.23)、丙氨酸(1.46，1.47)、葡萄糖(3.4～4.0)、脂類(0.86)等。運動過程中乳酸、β-羥丁酸、丙酮、脂類等譜峰隨運動時間不斷增大，而糖類則相反。另外運動過程中膽堿和磷酸膽堿譜峰減小也是較典型改變(圖1)。

小鼠血清LED1H NMR譜顯示運動過程中血清脂類相關代謝產(chǎn)物隨游泳時間也發(fā)生相應變化，主要波峰有極低密度脂蛋白(VLDL，1.18，1.34，1.38)、低密度脂蛋白(LDL ，0.9，1.3)、高密度脂蛋白(HDL，0.82，0.86，1.26)、不飽和脂肪酸(5.3)、脂質(1.58)、磷脂酰膽堿(3.22)、N-乙酰糖蛋白(N-acetylglycoprotein，2.02)、O-乙酰糖蛋白(O-acetylglycoprotein，2.14)。運動后脂蛋白、不飽和脂肪酸、脂質、NAc譜峰明顯增大，磷脂酰膽堿、OAc譜峰減小。

2.2 CPMG實驗1H NMR圖譜模式識別

小鼠血清CPMG實驗1H NMR譜波峰積分值的PLS-DA結果見圖2。3個游泳組代謝模式與正常對照組有明顯差異，隨著游泳時間延長差異有逐漸增大的趨勢。從因子載荷圖中可以發(fā)現(xiàn)導致這種差異的主要代謝產(chǎn)物，其中較正常對照組升高的化合物有β-羥丁酸、乙酸、乳酸，降低的化合物有葡萄糖、膽堿、磷酸膽堿、丙氨酸等。

2.3 LED實驗1H NMR圖譜模式識別

正常對照組與其他三組基本沿t1方向分離，30min組、120min組沿t2方向與60min游泳組有一定差異。從因子載荷圖可以看出，與正常對照組相比，游泳后小鼠血清磷脂酰膽堿水平降低，而HDL、LDL和VLDL等脂蛋白以及不飽和脂肪酸、N-乙酰糖蛋白、脂質水平等均明顯升高。排除正常對照組，對3個游泳組進行比較，結果表明，隨著游泳時間延長，HDL、LDL和VLDL等脂蛋白以及不飽和脂肪酸、N-乙酰糖蛋白、脂質水平均相應升高，而磷脂酰膽堿水平則逐漸降低。

Fig.1 Serum spectra of 600-MHz 1H NMR in rats after different time of loading swimming

3 討論

用于運動性疲勞研究的模型有多種，本研究以非耐力訓練的小鼠為研究對象，采用一次性負重游泳的方式建立疲勞模型，可以直接分析疲勞過程生理、生化改變，避免反復訓練過程由于疲勞-恢復-適應等過程帶來的影響，結果更適用于針對一般人群或非訓練人群的代謝研究需要。

Fig.2 Scores and loading plot derived from CPMG 1H NMR of the mice serum

Fig.3 Scores and loading plot from LED 1H NMR of the mice serum

代謝組分析結果表明，疲勞后血清成分發(fā)生顯著變化，對代謝表型改變具有明顯貢獻的化合物主要有三大營養(yǎng)物質及其代謝中間產(chǎn)物如β-羥基丁酸、乳酸、丙氨酸、葡萄糖、脂蛋白、糖蛋白、脂肪酸等，與文獻報告基本一致[3]。另外本研究發(fā)現(xiàn)運動過程中膽堿、磷酸膽堿和磷脂酰膽堿水平較正常對照組均明顯降低，值得關注。運動過程隨著糖類物質大量消耗，脂肪動員加強，導致大量游離脂肪酸釋放入血，長鏈脂肪酸必須經(jīng)活化成脂酰CoA，再通過肉堿脂酰轉移酶Ⅰ轉運，才能進入線粒體內(nèi)膜氧化[4]。如果游離脂肪酸不能與肉堿結合，就會通過脂肪酸穿梭作用破壞線粒體膜電位，干擾ATP合成[5]。肉堿的生物合成需要S-腺苷甲硫氨酸提供活性甲基供體。膽堿可以氧化為甜菜堿參與蛋氨酸再甲基化途徑，間接參與S-腺苷甲硫氨酸的合成。在蛋氨酸再甲基化途徑中，高半胱氨酸在甜菜堿高半胱氨酸甲基轉移酶作用下，可由甜菜堿提供活性甲基轉變?yōu)閮?nèi)源性蛋氨酸，繼而在甲硫氨酸腺苷轉移酶作用下轉變?yōu)镾-腺苷甲硫氨酸(SAM)參與肉堿合成代謝[6]。因此膽堿可能通過參與肉堿合成而影響脂肪酸氧化。運動后機體膽堿和磷酸膽堿水平均下降可能是制約機體脂肪酸氧化供能的一個關鍵環(huán)節(jié)，這可能是導致機體能量合成不足以及出現(xiàn)疲勞的一個重要原因。作為代償機制，膜結構中的磷脂酰膽堿可能部分分解釋放入血，這樣又可能導致膜正常結構和功能的異常。本研究所觀察到的糖蛋白水平變化可能與之相關。N-乙酰糖蛋白和O-乙酰糖蛋白都是細胞膜正常組分，血中含量變化很可能是細胞膜受損傷的表現(xiàn)。

作為機體重要的甲基供體之一，膽堿類物質還可能通過影響DNA甲基化從而調(diào)節(jié)運動后基因表達，對機體代謝發(fā)揮作用。DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)的作用下，將SAM提供的甲基共價結合到CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位上的過程，是最常見的表觀遺傳(epigenetic)現(xiàn)象[7]。合成SAM需要葉酸、VitB12、甲硫氨酸、膽堿和甜菜堿等營養(yǎng)物質，膽堿缺乏可直接導致SAM水平降低，引起實驗動物多種結構或功能基因低甲基化或超甲基化，表達出現(xiàn)異常，并導致機體功能異常改變[8]。運動后機體某些基因表達出現(xiàn)顯著改變，這些變化與運動過程機體代謝方式相適應，機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有賴于不同表達基因間的相互作用與協(xié)調(diào)[9]?？梢酝茰y運動后機體膽堿類水平下降可能也會涉及運動誘發(fā)相關基因甲基化異常，表達出現(xiàn)異常，導致機體代謝出現(xiàn)紊亂，這可能是疲勞發(fā)生的另一個重要原因。

綜上所述，本研究采用1H NMR方法分析了不同時間負重游泳對小鼠血清代謝組的影響，探討了本研究模型中物質代謝的基本特點及其變化規(guī)律。結合運動過程中能量代謝特點以及脂肪動員的特殊意義，針對膽堿類物質代謝規(guī)律和作用開展營養(yǎng)抗疲勞研究應該是一項值得考慮的工作。

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