黃 萍，范小芳，龐玲霞，高鈺琪，毛孫忠，胡良岡，洪 林，陳 然，龔永生，△

(1.溫州醫(yī)學(xué)院低氧醫(yī)學(xué)研究所肺心病研究室，2.機(jī)能實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，3.科技處，浙江 溫州 325035;4.第三軍醫(yī)大學(xué)高原醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038)

Apelin是從牛胃分泌物中提取出的新的小分子活性多肽，其受體是G蛋白耦聯(lián)受體—血管緊張素受體AT-1相關(guān)蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT-1，APJ)[1]。有資料表明，在心血管系統(tǒng)方面，Apelin表現(xiàn)出獨(dú)特的舒張血管、降低血壓、增強(qiáng)心肌收縮力的雙重有利效應(yīng)[2，3]。我們前期的工作發(fā)現(xiàn)低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)大鼠心肺組織中Apelin-APJ系統(tǒng)明顯改變，提示Apelin-APJ系統(tǒng)與HPH的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。新近，我們?cè)谡w模型上發(fā)現(xiàn)，經(jīng)微量滲透泵給予Apelin-13對(duì)大鼠的HPH和肺血管重構(gòu)有防治作用，其機(jī)制可能與一氧化氮途徑有一定的關(guān)系[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在離體水平上，觀察Apelin對(duì)肺動(dòng)脈環(huán)的舒張作用及其與NO途徑的關(guān)系;并比較低氧大鼠的肺動(dòng)脈環(huán)對(duì)Apelin的反應(yīng)是否與正常大鼠存在差異。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

Apelin-13(以下簡(jiǎn)稱Apelin)購自英國Tocris Inc;乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)，Nω-硝基-L-精氨酸甲酯[N(omega)-nitro-L-Arginine methyl ester，L-NAME]，可溶性鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑1H-[1，2，4]草酸重氮[4，3-α]喹嗯啉-1-酮 (1H-[1，2，4]oxadiazolo[4，3-α]quinoxaline-1-one，ODQ)購自Sigma公司;去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)購自上海禾豐制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào):6A11005。重碳酸鹽緩沖液(Krebs-Henseleit，K-H 液):內(nèi)含 NaCl 120，KCl 5.5，CaCl22.5，MgCl2?6H2O 1.2 ，NaH2PO41.2 ，NaHCO320，EDTA-Na20.03 ，Dextrose10，單位為mmol/L ，pH 7.2～ 7.4。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型復(fù)制

清潔級(jí)雄性S D大鼠36只，體質(zhì)量250～300g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào):SCXK(浙)2005-0019]。將大鼠隨機(jī)分為正常組24只與低氧組12只，按照我室以往的方法[5]復(fù)制HPH的動(dòng)物模型，即將低氧組大鼠置于常壓低氧艙內(nèi)，充入N2使氧濃度維持在9%～11%，CO2濃度維持在低于3%，每天8 h，每周6 d，連續(xù)4周。正常組除吸入空氣外，其他條件與低氧組相同。

1.3 模型指標(biāo)測(cè)定

大鼠飼養(yǎng)4周后，隨機(jī)取正常組和低氧組各6只進(jìn)行模型指標(biāo)測(cè)定。術(shù)前禁食過夜，自由飲水。戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔麻醉，將右心導(dǎo)管自右頸外靜脈插管至肺動(dòng)脈，并行左頸總動(dòng)脈插管，經(jīng)PowerLab系統(tǒng)分別記錄并計(jì)算平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)與平均頸動(dòng)脈壓(mean carotid arterial pressure，mCAP)。放血處死大鼠，迅速剪開胸腔取出心肺，剪去心房組織，沿室間隔剪下右心室，分別稱量右心室(RV)和左心室+室間隔(LV+S)的重量，計(jì)算Herman-Willson指數(shù)=[RV/(LV+S)]，以反映右心室肥大程度。以mPAP與RV/(LV+S)作為慢性肺動(dòng)脈高壓和右心室肥厚的模型指標(biāo)。

1.4 肺主動(dòng)脈環(huán)的制備和肺動(dòng)脈環(huán)張力的測(cè)定

頸椎脫臼法處死大鼠并迅速打開胸腔，取出心肺，小心去除肺動(dòng)脈周圍結(jié)締組織后將血管剪成約3～4 mm寬的血管環(huán)，將血管環(huán)放入含K-H液的浴槽內(nèi)，持續(xù)通以95%O2+5%CO2的混合氣體，緩慢將靜息張力調(diào)至1000mg;37℃下穩(wěn)定90min，期間每15 min換液一次。待血管穩(wěn)定后，向浴槽中加入1μmol/L的NE使血管收縮，待肺血管收縮穩(wěn)定后開始實(shí)驗(yàn)。

1.4.1 血管舒張效應(yīng)的檢驗(yàn) 10μmol/L ACh作用后血管舒張60%～80%，則認(rèn)為內(nèi)皮完整;如舒張幅度小于10%，則視為去內(nèi)皮成功。以加入藥物后的血管張力變化幅度與NE誘發(fā)最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化。

1.4.2 Apelin對(duì)大鼠肺動(dòng)脈環(huán)的舒張作用 觀察向浴槽內(nèi)加入不同濃度的Apelin后，正常大鼠內(nèi)皮完整(n=18)的、去內(nèi)皮(n=8)的和低氧大鼠(n=10)的肺主動(dòng)脈環(huán)張力的變化。Apelin終濃度分別為 0.01 nmol/L 、0.1 nmol/L、1 nmol/L 、10nmol/L 、100nmol/L。每隔1 min加一次藥。

1.4.3 L-NAME、ODQ對(duì)Apelin舒張大鼠肺動(dòng)脈環(huán)作用的影響 在正常組大鼠離體肺動(dòng)脈環(huán)的浴槽中加入終濃度達(dá) 10μmol/L的L-NAME或ODQ(n=18)，預(yù)孵育血管半小時(shí)后，換液，再向浴槽內(nèi)加入1μmol/L NE，待收縮平衡后，依次向浴槽內(nèi)加入Apelin，終濃度為 0.01 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10nmol/L 、100nmol/L。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用不同濃度下的血管收縮值制備劑量-效應(yīng)曲線，在每次實(shí)驗(yàn)中分別計(jì)算舒張百分?jǐn)?shù)，半數(shù)有效濃度(EC50)值用Scatchar法將濃度-效應(yīng)曲線轉(zhuǎn)化為直線后通過回歸運(yùn)算求得。數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Apelin對(duì)NE預(yù)收縮的肺主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

在0.01～100nmol/L的濃度范圍內(nèi)，Apelin具有濃度依賴性舒張內(nèi)皮完整的正常離體大鼠肺主動(dòng)脈環(huán)的作用，在Apelin濃度為100nmol/L時(shí)對(duì)預(yù)收縮的肺主動(dòng)脈環(huán)的舒張率達(dá)到10.62%±2.60%(圖1)。

Fig.1 Vasorelaxation to apelin on normoxic rat pulmonary arterial rings

Fig.2 Relaxation of apelin on rat main pulmonary arterial rings and effects of endothelium-denude

Fig.3 Relaxation to apelinon normoxic rat main artery:effectsof L-NAME or ODQ

2.2 Apelin對(duì)去內(nèi)皮大鼠肺動(dòng)脈環(huán)舒張效應(yīng)的影響

去內(nèi)皮后，各濃度Apelin舒張正常大鼠肺動(dòng)脈環(huán)的效應(yīng)明顯減弱(P均＜0.01，圖2)。

2.3 L-NAME和ODQ對(duì)Apelin舒張大鼠離體肺主動(dòng)脈環(huán)效應(yīng)的影響

用一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)或可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)抑制劑(ODQ)預(yù)孵育后，各濃度Apelin舒張正常大鼠肺動(dòng)脈環(huán)的效應(yīng)明顯減弱(P均＜0.01，圖3)。

2.4 慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的建立

低氧組大鼠的mPAP與RV/(LV+S)分別比正常組高40.1%(P＜0.01)、32.0%(P＜0.01)，兩組間的mCAP無顯著性差異(P＞0.05，圖4)。

Fig.4 Changes of mPAP，RV/(LV+S)and mCAP

2.5 Apelin舒張慢性HPH大鼠離體肺動(dòng)脈的效應(yīng)

HPH大鼠離體肺動(dòng)脈環(huán)對(duì)Apelin的反應(yīng)減弱，在濃度為100nmol/L時(shí)，Apelin對(duì)低氧組肺主動(dòng)脈離體血管環(huán)的舒張幅度下降60.5%(P＜0.01，圖5)。低氧組 EC50=(1.02±0.21)nmol/L，正常組EC50=(0.81±0.25)nmol/L，兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。

Fig.5 Vasorelaxation to apelin in hypoxic ratmain pulmonary arteries

3 討論

Apelin是新發(fā)現(xiàn)的具有維持體液穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)垂體激素分泌、攝食、呼吸和生物節(jié)律等多功能的活性肽。在人與哺乳動(dòng)物的多種組織器官(心臟、肺、血管、腦、腎等)中均發(fā)現(xiàn)Apelin及其受體APJ mRNA和蛋白的表達(dá)，其中以肺臟中的聯(lián)合表達(dá)最高[6]，這提示:Apelin-APJ系統(tǒng)對(duì)肺循環(huán)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)可能具有特殊的意義。以往的離體實(shí)驗(yàn)對(duì)Apelin舒張血管效應(yīng)的研究大多集中在胸主動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈、腎動(dòng)脈等血管上[7，8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在以去甲腎上腺素引起的預(yù)收縮的大鼠離體肺主動(dòng)脈環(huán)模型上，Apelin對(duì)大鼠肺主動(dòng)脈環(huán)具有舒張作用。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Apelin對(duì)去除內(nèi)皮后的肺動(dòng)脈環(huán)的舒張效應(yīng)明顯低于內(nèi)皮完整組。其機(jī)理可能是內(nèi)皮細(xì)胞上存在G蛋白耦聯(lián)受體APJ，而Apelin是APJ的內(nèi)源性天然配體，Apelin與APJ結(jié)合后上調(diào)NO而發(fā)揮擴(kuò)張血管的作用[7，9]，所以當(dāng)血管去除內(nèi)皮的同時(shí)也破壞了內(nèi)皮上APJ，致使Apelin經(jīng)血管內(nèi)皮APJ途徑的舒張血管作用消失。

Tatemoto等[3]發(fā)現(xiàn)，Apelin在體內(nèi)可增加NO的生成，其舒張血管效應(yīng)在很大程度上通過NO信號(hào)途徑介導(dǎo)。另外，在離體孵育的大鼠主動(dòng)脈組織上發(fā)現(xiàn)，Apelin可濃度依賴性增加大鼠主動(dòng)脈NO的生成及NOS活性，提示Apelin舒張血管效應(yīng)與NO/NOS系統(tǒng)密切相關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):對(duì)于正常大鼠的肺主動(dòng)脈環(huán)，一氧化氮合酶抑制劑L-NAME能明顯抑制Apelin的舒血管效應(yīng)，首次在離體水平上提示Apelin舒張肺動(dòng)脈的作用與NO/NOS系統(tǒng)有關(guān)，這與我們?cè)谡w實(shí)驗(yàn)上所發(fā)現(xiàn)的Apelin對(duì)HPH和肺血管重構(gòu)的防治作用與NO途經(jīng)有關(guān)的結(jié)果相一致[5]。已知NO是在內(nèi)皮NOS的作用下由L-精氨酸轉(zhuǎn)化而來，并通過激活平滑肌細(xì)胞sGC，增加cGMP含量而使血管平滑肌舒張[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，sGC抑制劑ODQ明顯抑制Apelin的舒血管效應(yīng)，提示NO-sGC-cGMP信號(hào)途徑介導(dǎo)了Apelin舒張肺血管的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:低氧組較正常組大鼠的mPAP、RV/(LV+S)顯著升高，這表示肺動(dòng)脈高壓模型已建立成功。與正常組相似，Apelin呈濃度依賴性地舒張低氧大鼠的離體肺主動(dòng)脈環(huán)，但舒張效應(yīng)明顯低于正常組。這與Salcedo A、Zhong JC 等[7，8]報(bào)道Apelin對(duì)病理狀態(tài)下離體腸系膜動(dòng)脈、主動(dòng)脈的舒張效應(yīng)減弱相類似。結(jié)合文獻(xiàn)，Apelin對(duì)HPH大鼠離體肺主動(dòng)脈的舒張效應(yīng)降低可能是由于:一方面，HPH大鼠肺主動(dòng)脈Apelin的受體APJ可能下調(diào)，致使Apelin經(jīng)Apelin-APJ系統(tǒng)發(fā)揮的舒血管效應(yīng)減弱。兩組EC50比較無顯著性差異，說明同一半數(shù)有效濃度的Apelin作用于低氧大鼠肺血管內(nèi)皮時(shí)可能由于APJ受體減少而使Apelin與APJ的結(jié)合減少、親和力減弱，從而使Apelin對(duì)血管的舒張作用減弱。另一方面，Apelin舒張血管的效應(yīng)具有明顯的血管內(nèi)皮依賴性，而在HPH的發(fā)生過程中，可能導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙(如存在NOS的釋放不足等)，使得血管本身對(duì)Apelin等小分子活性物質(zhì)的反應(yīng)降低。此外，Apelin對(duì)低氧組肺主動(dòng)脈的舒張效應(yīng)明顯減弱也可能與低氧情況下肺細(xì)小動(dòng)脈管壁增厚，中層平滑肌增生，使得肺血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)和肺血管重建有關(guān)。

綜上所述，Apelin具有內(nèi)皮依賴性的舒張大鼠離體肺動(dòng)脈環(huán)的作用，該作用主要通過NO-sGC-cGMP途徑來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于低氧大鼠的離體肺動(dòng)脈環(huán)，Apelin的舒張效應(yīng)減弱。

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