張?jiān)伬?，崔玉?qiáng)，石志強(qiáng)，毛建文，李紅枝，林桂芳，冀軍鋒（.廣東藥學(xué)院，廣州市 50006；.廣州市黃埔區(qū)紅十字會(huì)醫(yī)院，廣州市 50760；.廣東中山市火炬開(kāi)發(fā)區(qū)醫(yī)院，中山市 587；.廣東中山市尤利卡天然藥物有限公司，中山市 587）

核桃楸（Juglans mandshurica Maxim.）為胡桃科胡桃屬植物，屬落葉喬木，異名有山核桃（《東北常用中草藥手冊(cè)》）、馬核桃（《中國(guó)樹(shù)木分類學(xué)》）及楸馬核果（《中國(guó)藥用植物圖鑒》）等。核桃楸樹(shù)皮主要含有胡桃醌和大量的鞣質(zhì)，以及苷類和多縮戊糖等[1]，核桃楸樹(shù)皮中可能還含有黃酮類、生物堿、酚類、蒽醌及強(qiáng)心苷等物質(zhì)[2]。近幾年，不斷有學(xué)者從中分離出新的活性成分[3，4]，包括一些多酚及苷類成分，并顯示出較好的生物學(xué)功能[5，6]。筆者通過(guò)分級(jí)萃取、硅膠柱分離和質(zhì)譜分析，初步探索了萃取相中活性較高的成分組成，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用核桃楸樹(shù)皮的藥用成分提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity UPLC-Q-Tof MICRO MS型液相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）；SB-5200DT型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝儀器公司）；RE-52CS型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；超純水儀（美國(guó)Milli-Q公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）。

1.2 試藥

供試藥材采購(gòu)自黑龍江省伊里嘎山，為曬干后天然制品，經(jīng)黑龍江省藥材公司劉麗萍藥師鑒定為野生核桃楸（J.mandshurica Maxim.）樹(shù)皮。無(wú)水乙醇、甲醇采購(gòu)自江蘇強(qiáng)盛化工有限公司，均為色譜純；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿均采購(gòu)自天津富宇精細(xì)化工有限公司，均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 萃取 將核桃楸樹(shù)皮粉碎，取500 g樹(shù)皮粉末用70%乙醇回流提取3次，第1次6 L回流3 h，后2次5 L回流2 h。合并提取液，減壓濃縮，收集浸膏。用5倍水溶解，抽濾，保存濾渣。濾液分別用乙醚、乙酸乙酯、飽和正丁醇萃取，各相萃取10次，每次300 mL，合并各萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。經(jīng)過(guò)MTT細(xì)胞毒性篩查試驗(yàn)，確定乙酸乙酯萃取相抗腫瘤活性較高，故選取乙酸乙酯相進(jìn)一步細(xì)分。

2.1.2 硅膠柱分離 取乙酸乙酯萃取相500 mg，溶于1 mL甲醇中，12000 r·min-1離心去不溶物，得深褐色濃縮液，濕法氯仿裝柱，小心上樣，保持柱面平整，純氯仿洗脫，速度控制在每分鐘100滴左右，可見(jiàn)一淡黃色條帶出現(xiàn)，其后跟隨有橙紅色條帶下移，持續(xù)用氯仿洗脫分別合并洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，50℃真空干燥，分別得到供試品Ⅰ、Ⅱ。

2.1.3 MS條件 兩供試品均用甲醇溶解，MS設(shè)定條件為毛細(xì)管電壓：3500 V；錐孔電壓：20 V；離子能量電壓：2.0 V；離子源溫度：120℃；脫溶劑溫度：350℃；碰撞能量電壓：10 V。

2.2 結(jié)果

乙酸乙酯萃取相經(jīng)硅膠柱分離，分別得到2個(gè)條帶，條帶Ⅰ呈淡黃色，條帶Ⅱ呈橙紅色，分別收集濃縮。從陽(yáng)離子質(zhì)譜結(jié)果分析，兩供試品成分可能較為復(fù)雜，供試品I中2個(gè)主要成分的質(zhì)譜分子量在317和437左右；樣品Ⅱ中3個(gè)主要成分的質(zhì)譜分子量在303、437和453左右，其中質(zhì)譜分子量303、317、437的組分在供試品Ⅰ和Ⅱ均有出現(xiàn)，詳見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 供試品Ⅰ陽(yáng)離子質(zhì)譜圖Fig 1 Positive ion mass spectrum of sampleⅠ

圖2 供試品Ⅱ陽(yáng)離子質(zhì)譜圖Fig 2 Positive ion mass spectrum of sampleⅡ

3 討論

由陽(yáng)離子質(zhì)譜圖可以看出，本次分離的兩供試品Ⅰ和Ⅱ中，成分較為復(fù)雜，分子質(zhì)量在303左右處，碎片峰有[M-H]－m/z 301，[M+H]+m/z 303，分子離子M+m/z 302。阮棟梁等[7]通過(guò)硅膠柱和葡聚糖凝膠柱層析，從沙棘葉子中分離并鑒定出黃酮類成分，并采用核磁和質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，并確認(rèn)為是槲皮素。曾海波等[8]利用色譜技術(shù)從枸骨根中分離出1個(gè)黃酮類化合物，通過(guò)高分辨質(zhì)譜以及核磁共振技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，表明該化合物是槲皮素。石建輝等[9]從核桃楸樹(shù)皮中分離出槲皮素，分子式為C15H10O7，分子量302.23。黃酮類化合物質(zhì)譜圖中分子離子峰應(yīng)為偶數(shù)，通常是以主峰的形式出現(xiàn)，而且必須是一個(gè)合理的分子量。如，黃酮、異黃酮類化合物分子量以222為基數(shù)；黃烷酮和查爾酮類化合物分子量為324；黃酮醇類化合物分子量為238；雙氫黃酮類化合物分子量為240等。每加一個(gè)-OH就要增加16個(gè)質(zhì)量單位，以此類推。因此，判斷分子離子303[M+m/z 302]是黃酮醇類化合物增加了4個(gè)-OH。筆者由此推測(cè)供試品Ⅰ和Ⅱ中在303左右出峰的物質(zhì)可能為槲皮素。在318左右處有碎片峰[M-H]－m/z 317，[M+H]+m/z 319，故分子離子為M+m/z 318，按照上述理論，M+m/z 318是黃酮醇類化合物增加了5個(gè)-OH。石建輝等[10]在核桃楸樹(shù)皮乙酸乙酯萃取相中也分離到一種分子量為318的淡黃色粉末成分，通過(guò)色譜及核磁方法鑒定為一種黃酮化合物C15H10O8，即楊梅苷。因此，可初步推定此處成分可能為楊梅苷。分子離子為437及453未能查到與現(xiàn)有文獻(xiàn)匹配，有可能是該樹(shù)皮醇提物中的新化合物，且其相差16，可能也為黃酮類化合物，相差一個(gè)-OH，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3。

圖3 2種黃酮類化合物結(jié)構(gòu)式Fig 3 Structural formula of 2 kinds of flarvanoid compound

綜上所述，本研究采用醇提及溶劑分級(jí)萃取的方法提取核桃楸樹(shù)皮醇提物中的有效成分，并采用硅膠柱層析法進(jìn)行分離純化，質(zhì)譜法檢測(cè)成分，對(duì)氯仿洗脫下的2個(gè)條帶供試品進(jìn)行了分析，推斷其可能含有的主要成分為槲皮素和楊梅苷，同時(shí)發(fā)現(xiàn)2個(gè)不明成分，有必要通過(guò)更進(jìn)一步的方法進(jìn)行分離檢測(cè)，從中分離得到新的成分。

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