陳祖云，石凌云，黃勇，喬希，王愛民，況時(shí)詳，王永林#（.貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽市 550004；.貴陽中醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，貴陽市 55000）

腦通顆粒處方源于貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院臨床使用的醫(yī)院制劑方，主要由黃芪、水蛭、葛根、天麻、西洋參組成，臨床用于治療心脾氣虛、清陽不升、腦絡(luò)不利、腦髓失養(yǎng)等，屬現(xiàn)代輕度血管性老年癡呆范疇，治療效果良好。為了更好地控制腦通顆粒的質(zhì)量，保證其療效，本試驗(yàn)采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HPLC-ELSD）法對該制劑主要組成藥材黃芪中黃芪甲苷[1～3]和西洋參中含量較高的人參皂苷Rb1[4～6]進(jìn)行含量測定，并以這2種成分的含量為指標(biāo)考察該制劑的穩(wěn)定性。該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)；應(yīng)用該方法的測定結(jié)果表明，腦通顆粒中黃芪甲苷和人參皂苷Rb1的穩(wěn)定性良好。

1 儀器與試藥

Prominenece HPLC儀系統(tǒng)，包括2臺LC-20AD泵、DGU-20A3真空脫氣機(jī)、SIL-20AHT自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10ASvp柱溫箱、LC-Solution色譜工作站（日本島津公司）；Alltech ELSD 800蒸發(fā)光檢測器（美國奧泰科技公司）；WYB-5000型全自動(dòng)空氣泵（北京怡豐瑞普科技有限公司）；AE240十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）；CQ250A-TS超聲波清洗器（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）。

黃芪甲苷、人參皂苷Rb1對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110781-200613、110704-200921）；乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、正丁醇、氨水等試劑均為分析純；腦通顆粒（貴陽醫(yī)學(xué)院藥物研究開發(fā)中心制備，批號：20090910、20100405、20100410、20100417）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與ELSD條件

色譜柱：Elipse-XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫（梯度見表1）；流速：1 mL·min-1；柱溫：40℃。ELSD器的漂移管溫度：40℃；霧化器壓力：0.30 MPa；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Steps of gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取黃芪甲苷對照品23.52 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為1號貯備液；精密稱取人參皂苷Rb1對照品23.50 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為2號貯備液。

分別取人參皂苷Rb1和黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，以甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rb10.8 mg和黃芪甲苷0.4 mg的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取裝量差異項(xiàng)下的本品，混勻，取適量，研細(xì)，取約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲（功率：100 w，頻率：50 kHz）處理20 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸至近干，殘?jiān)影痹囈?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次25 mL，合并正丁醇層，用正丁醇飽和的水50 mL振搖提取，分取正丁醇層，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，移? mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 分別取缺西洋參、黃芪藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別吸取黃芪甲苷和人參皂苷Rb1混合對照品溶液、供試品溶液、缺黃芪的陰性對照溶液和缺西洋參的陰性對照溶液各適量，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，黃芪甲苷和人參皂苷Rb1與其他組分峰的分離度均＞1.5，缺黃芪的陰性對照不干擾西洋參中人參皂苷Rb1的測定，缺西洋參的陰性對照不干擾黃芪中黃芪甲苷的測定。理論板數(shù)以黃芪甲苷峰計(jì)算為12000，以人參皂苷Rb1峰計(jì)算為8300。色譜見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取1號貯備液和2號貯備液0.25、0.5、1、2、4 mL，分置5個(gè)10 mL容量瓶中，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 μL注入液相色譜儀。以進(jìn)樣濃度的常用對數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，峰面積的常用對數(shù)（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得黃芪甲苷的線性回歸方程為Y＝1.346X+6.965（r＝0.9989，n＝5）；人參皂苷Rb1的線性回歸方程為Y＝1.628X+6.756（r＝0.9991，n＝5）。結(jié)果表明，黃芪中黃芪甲苷和西洋參中人參皂苷Rb1的檢測濃度分別在0.0588～0.9408、0.1196～1.9135 mg·mL-1范圍內(nèi)的對數(shù)值與各自峰面積的對數(shù)值呈良好線性關(guān)系。

圖1 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測圖A.和混合對照品；B.供試品；C.缺西洋參的陰性對照；D.缺黃芪的陰性對照；1.黃芪甲苷；2.人參皂苷Rb1Fig 1 HPLC-ELSD chromatogramsA.mixed control；B.test sample；C.negative control without Panax quinque；D.negative control without Astragali Radix；1.astragalosideⅣ；2.ginsenoside Rb1

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 中間精密度試驗(yàn) 以不同的實(shí)驗(yàn)人員在不同時(shí)間照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別制備3份，按上述方法分別測定后計(jì)算各指標(biāo)含量。第一次測定結(jié)果黃芪甲苷的RSD＝4.0%（n＝3），人參皂苷Rb1的RSD＝0.67%（n＝3）；第二次測定結(jié)果黃芪甲苷的RSD＝4.24%（n＝3），人參皂苷Rb1的RSD＝1.06%（n＝3），表明該方法的中間精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（批號：20090910）樣品，按8、10、12 g稱量，每組3份，精密稱定，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測定，計(jì)算各指標(biāo)含量。結(jié)果，黃芪甲苷和人參皂苷Rb1的RSD分別為3.4%和2.9%（n均為9），表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 耐用性試驗(yàn)

取樣品適量，照“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備3份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣：（1）以不同色譜柱[Agilent Eclipse-XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm ）、Waters Symmetry C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）]進(jìn)行測定，結(jié)果黃芪甲苷的RSD分別為3.6%和2.9%，人參皂苷Rb1的RSD分別為1.7%和1.6%。（2）以不同色譜柱溫度（35、40、45℃）進(jìn)行測定，結(jié)果黃芪甲苷的RSD分別為3.1%、4.3%和3.9%，人參皂苷Rb1的RSD分別為2.0%、1.3%和2.1%。（3）以不同霧化器壓力（0.28、0.30、0.32 MPa）進(jìn)行測定，結(jié)果黃芪甲苷的RSD分別為2.9%、2.4%和4.4%，人參皂苷Rb1的RSD分別為1.7%、2.3%和2.3%。（4）以不同漂移管溫度（35、40、45℃）進(jìn)行測定，結(jié)果黃芪甲苷的RSD分別為3.2%、2.8%和3.2%，人參皂苷Rb1的RSD分別為2.7%、1.2%和1.8%，表明該方法的耐用性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，分別于0、1、2、4、8 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，黃芪甲苷峰面積的RSD＝3.2%（n＝5），人參皂苷Rb1峰面積的RSD＝2.9%（n＝5），表明供試品溶液中黃芪甲苷和人參皂苷Rb1在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已測定含量的樣品（批號：20090910，黃芪甲苷含量：0.1886 mg·g-1；人參皂苷Rb1含量：0.6551 mg·g-1）5 g，共9份，精密稱定，每3份分別精確加入低、中、高3種濃度的對照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果分別見表2、表3。

表2 黃芪甲苷的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests of astragalosideⅣ（n＝9）

表3 人參皂苷Rb1的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests of ginsenoside Rb1（n＝9）

2.9 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定并計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表4 3批樣品含量測定結(jié)果Tab 4 Results of content determination of 3 batches of samples

2.10 制劑中黃芪甲苷和人參皂苷Rb1穩(wěn)定性考察

為考察制劑中黃芪甲苷和人參皂苷Rb1的穩(wěn)定性，取3批樣品（批號：20100405、20100410、20100417）進(jìn)行加速試驗(yàn)考察。取模擬上市包裝樣品適量，置（40±2）℃、（75±5）%RH條件下貯藏，于0、1、2、3、6個(gè)月取樣，照含量測定方法檢測。結(jié)果，批號分別為20100405、20100410和20100417的樣品中黃芪甲苷的含量每袋分別為 1.030、1.210、0.992、1.180、0.983 mg，1.050、0.986、1.130、0.979、0.961 mg，1.060、1.220、1.150、0.985、0.972 mg；人參皂苷Rb1的含量每袋分別為4.01、3.94、4.12、3.89、4.19 mg，3.94、4.02、3.88、3.97、3.72 mg，4.18、4.25、4.08、4.04、4.11 mg。結(jié)果表明，經(jīng)加速試驗(yàn)6個(gè)月考察，制劑中黃芪甲苷和人參皂苷Rb1的含量無明顯變化，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

由于黃芪甲苷和人參皂苷Rb1為紫外末端吸收，采用200 nm左右的檢測波長時(shí)，雜質(zhì)對色譜峰干擾大，而ELSD器對皂苷類化合物有較好的響應(yīng)，故試驗(yàn)選擇HPLC-ELSD法測定指標(biāo)含量。為使黃芪甲苷和人參皂苷Rb1不受到雜質(zhì)的干擾，需降低流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例，這卻使上述2種化合物的出峰時(shí)間延長、峰形變寬、檢測靈敏度降低，故參考有關(guān)文獻(xiàn)和試驗(yàn)，以乙腈-水系統(tǒng)為流動(dòng)相采用梯度洗脫，可使被測定成分與干擾物質(zhì)較好地分離開來。

3.2 提取條件的考察

方中西洋參、黃芪是以提取物的形式存在于制劑中，其所含的黃芪甲苷和人參皂苷Rb1溶解于甲醇，因此采用甲醇為溶劑進(jìn)行超聲提??；由于提取后直接測定時(shí)干擾物質(zhì)多，故以氨試液溶解甲醇提取濃縮的殘?jiān)?，再采用正丁醇萃取黃芪和人參皂苷Rb1，從而除去干擾雜質(zhì)。

3.3 穩(wěn)定性考察

在本制劑黃芪甲苷和人參皂苷Rb1穩(wěn)定性考察試驗(yàn)中，除對黃芪甲苷和人參皂苷Rb1的含量測定外，還分別考察了性狀、鑒別、粒度、水分、溶化性、微生物限度，均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，說明本品在6個(gè)月內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定，直接接觸藥品的容器對藥品質(zhì)量未見影響（長期試驗(yàn)仍在進(jìn)行中）。

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