徐玲，張繼芬，吳芳洲，張輝，徐曉玉（西南大學藥學院/西南大學中藥研究所，重慶市 400715）

雙花顆粒系西南大學中醫(yī)藥學院徐曉玉教授在中醫(yī)藥理論的指導下精心研制的中藥復方制劑。其主要成分為山銀花，具有抑菌、消炎、保肝的功效[1，2]。2005年版《中國藥典》中記載山銀花含綠原酸，為其公認的主要有效成分，因此本研究采用綠原酸作為雙花顆粒含量測定的指標成分。

有關綠原酸含量測定的方法有高效液相色譜（HPLC）法[3]、薄層色譜-紫外分光光度（TLC－UV）法[4]、毛細管區(qū)帶電泳法[5]、薄層掃描法[6]等。本試驗采用HPLC法測定雙花顆粒中綠原酸的含量，方法準確、簡便、可靠，可用于雙花顆粒的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1200 series HPLC儀（美國Agilent公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；JA2003N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。

綠原酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110753-200413）；雙花顆粒（西南大學中藥研究所研制，規(guī)格：每袋2 g，批號：2009102502、2009102601、2009102701）；乙腈為色譜純，磷酸、甲醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取綠原酸對照品10.8 mg，置于100 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得108μg·mL-1的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 稱取雙花顆粒約2 g，研細，精密稱取約0.3 g，置25 mL容量瓶中，用50%甲醇20 mL超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）溶解30 min，放冷，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液 取不含山銀花的顆粒作為陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Shimpack VP-ODS（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸（10∶90）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：326 nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。采用外標法進行定量。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

分別吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液，按“2.2”項下色譜條件分別進行檢測。結果可得，綠原酸峰形良好，與其他組分能較好分離，陰性對照在綠原酸相應的保留時間附近無干擾峰。色譜見圖1。

2.4 標準曲線的制備

分別精密吸取對照品溶液（108 μg·mL-1）0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過，按上述色譜條件進樣20μL，記錄峰面積。以綠原酸進樣濃度（c）為橫坐標，峰面積積分值（A）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為A＝33.795c－34.767（r＝0.9997，n＝5）。結果表明，綠原酸進樣濃度在5.4～54.0μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關系。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.綠原酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test samples；C.negative control；1.chlorogenic acid

2.5 精密度試驗

取對照品溶液適量，重復進樣6次，測定綠原酸的峰面積。結果，RSD＝0.15%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣，測定綠原酸的峰面積。結果，RSD＝0.67%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：2009102701）適量，共6份，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，測定綠原酸的含量。結果，綠原酸的平均含量為10.01 mg·g-1，RSD＝1.4%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

稱取9份已知含量（10.12 mg·g-1，批號：2009102701）的樣品約0.15 g，精密稱定，分別加入對照品3個濃度梯度共9份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1。

2.9 樣品含量測定

取3批樣品（批號：2009102502、2009102601、2009102701）適量，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，取20μL進樣，按上述色譜條件測定峰面積，計算含量。結果，3批樣品中綠原酸的含量分別為 9.95、10.01、10.12 mg·g-1。

3 討論

3.1 檢測波長的確定

取綠原酸對照品在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結果表明，其最大吸收值在326 nm波長處，因此選用326 nm作為檢測波長。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

3.2 流動相的選擇

試驗在檢測波長為326 nm、進樣量為20μL、流速為1.0 mL·min-1的條件下，分別以乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）、乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83）、甲醇-水-冰醋酸（7∶92∶1）、乙腈-0.2%磷酸溶液（10∶90）為流動相，測定綠原酸對照品溶液和供試品溶液。結果表明，流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（10∶90）時，綠原酸的保留時間為28.4 min，且峰形良好。在此條件下對樣品進行分析，綠原酸與其他組分能較好分離，故選其作為流動相。

[1]林 都，王 榮，徐曉玉，等.雙花顆粒對小鼠肝損傷的保護作用[J].西南大學學報（自然科學版），2010，32（6）：48.

[2]王 榮，林 都，徐曉玉.雙花顆粒體外抑菌效果觀察[J].西南大學學報（自然科學版），2010，32（6）：85.

[3]陳 黎，王啟斌，朱海濤，等.HPLC法測定風濕Ⅱ號合劑中綠原酸的含量[J].中國藥房，2010，21（31）：143.

[4]張 軍，莊桂東，韓榮偉，等.TLC-UV法測定金銀花中綠原酸[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（3）：122.

[5]劉志梅，韓丹丹，李彩瑞，等.毛細管區(qū)帶電泳法測定中草藥中的有機酸[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報，2007，30（6）：114.

[6]王瑞明，靳秋萍，郝旭亮，等.薄層掃描法測定口腔寶中綠原酸含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2003，14（6）：334.