王玨，魏 媛，段京莉，倪君君，熊 歆，張現(xiàn)化（.北京大學(xué)第三醫(yī)院藥劑科，北京市 009；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，北京市 009；3.北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京市 009；.北京國(guó)立柏林醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司，北京市 009）

頭孢美唑鈉是一種半合成的頭霉素衍生物，抗菌性能與第2代頭孢菌素相近。大量臨床試驗(yàn)表明[1，2]，該藥對(duì)革蘭陽(yáng)性及陰性菌均具有良好的抗菌效能，對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、脆弱擬桿菌以及厭氧菌也有良好的抗菌活性，且對(duì)各種β-內(nèi)酰胺酶有很強(qiáng)的耐受性和穩(wěn)定性，可用于預(yù)防婦科、腹腔、泌尿道、呼吸道、皮膚及軟組織等部位的感染。目前，頭孢美唑鈉廣泛用于行剖宮產(chǎn)的產(chǎn)婦手術(shù)預(yù)防用藥，由于頭孢美唑鈉可透過胎盤屏障進(jìn)入胎兒血循環(huán)，而尚無(wú)數(shù)據(jù)表明本藥在胎兒中的安全性，因此對(duì)頭孢美唑鈉在臍帶血中的濃度進(jìn)行測(cè)定，可以幫助考察藥物對(duì)胎兒的影響。本研究建立了測(cè)定臍帶血中頭孢美唑鈉濃度的方法，并成功地應(yīng)用于臨床使用頭孢美唑鈉預(yù)防感染的剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦。

1 材料

1.1 儀器

1100高效液相色譜儀，包括脫氣機(jī)、泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、G1321A柱溫箱和紫外檢測(cè)器（FLD）（美國(guó)Agilent公司）；GB 204型電子天平（瑞士Mettler公司）；純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；TG16W臺(tái)式高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙易達(dá)儀器）；MS3 digital渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）。

1.2 試藥

頭孢美唑鈉對(duì)照品（第一三共制藥（上海）有限公司，批號(hào)：JPA0444，純度：98%）；注射用頭孢美唑鈉（第一三共普樂發(fā)株式會(huì)社，批號(hào)：JPA04639-11，規(guī)格：1 g）；內(nèi)標(biāo)：對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100018-200408，含量：99.69%）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），并配有Agilent Eclipse XDB-C184-Pack預(yù)柱（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.026 mol·L－1醋酸銨（pH 6.0）-甲醇（85∶15）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm ；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取1 g頭孢美唑鈉對(duì)照品，加純水5 mL溶解，搖勻后即得濃度為200 mg·mL－1的頭孢美唑鈉對(duì)照品母液，置冰箱4℃保存?zhèn)溆?。取一定量母液加純水，使之成為含頭孢美唑鈉2.5、5、10、40、100、250、500、1000 g·mL－1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 血漿樣品處理

精密取血漿100 μL于1.5 mL離心管中，精密加入內(nèi)標(biāo)（100 μg·mL－1對(duì)乙酰氨基酚）溶液10 μL，混勻后加入甲醇300 μL，于渦旋混合器上混合2 min沉淀蛋白，再置于高速離心機(jī)以12000 r·min－1離心10 min ，取上清液100 μL于另一離心管中，加入純水100 μL稀釋，混勻后進(jìn)樣分析。

2.4 專屬性考察

在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，頭孢美唑鈉的保留時(shí)間約為12.8 min，內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間約為5.4 min。結(jié)果表明，藥物、內(nèi)標(biāo)峰峰形較好，與雜質(zhì)峰分離效果好，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾頭孢美唑鈉及內(nèi)標(biāo)的色譜分析。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+500 μg·mL－1頭孢美唑鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液+內(nèi)標(biāo)Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+500 μg·mL－1cefmetazole sodium+internal standard

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取系列頭孢美唑鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，置于1.5 mL離心管中，加入空白血漿90 μL，制備成頭孢美唑鈉濃度為2.5、5、10、40、100、250、500、1000 μg·mL－1的血漿標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.3”項(xiàng)下步驟操作并進(jìn)行色譜分析，記錄色譜。以頭孢美唑鈉濃度（c）為橫坐標(biāo)，頭孢美唑鈉峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（A）為縱坐標(biāo)作圖，得線性回歸方程為A＝0.017c+0.083（r＝0.9994）。結(jié)果表明，頭孢美唑鈉血藥濃度在2.5～1000 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為2.5 μg·mL－1（測(cè)得值為（2.565±0.083）μg·mL－1，RSD為3.24%）。

2.6 精密度試驗(yàn)

配制含頭孢美唑鈉5、100、700 μg·mL－1的低、中、高3種濃度的血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法操作并進(jìn)樣分析。在不同天內(nèi)連續(xù)制備并測(cè)定3個(gè)分析批，每批樣品3個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度5份樣品，計(jì)算日內(nèi)、日間RSD。測(cè)定結(jié)果表明，血漿樣品分析的精密度、準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表1。

2.7 回收率試驗(yàn)

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery tests（n＝5）

按“2.6”項(xiàng)下方法配制低、中、高3種濃度的頭孢美唑鈉血漿樣品各5份，再于1.5 mL離心管中加入血漿90 μL和甲醇300 μL，渦旋2 min，12000 r·min－1離心10 min，按“2.3”項(xiàng)下方法操作并進(jìn)樣分析，并計(jì)算方法回收率。另以血漿樣品頭孢美唑鈉峰面積與相應(yīng)對(duì)照品溶液頭孢美唑鈉峰面積之比求算提取回收率，結(jié)果，血漿樣品平均提取回收率為95.70%（RSD＝4.58%）。精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制低、中、高3種濃度的頭孢美唑鈉血漿樣品，每個(gè)濃度4份，每份5個(gè)樣品。第1份立即按“2.3”項(xiàng)下方法操作；第2份室溫放置24 h后，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，考察頭孢美唑鈉血漿樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性；第3份反復(fù)凍融3次，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，考察頭孢美唑鈉在凍融條件下的穩(wěn)定性；第4份在－20℃的條件下冷凍1個(gè)月，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，以考察其凍存穩(wěn)定性。結(jié)果顯示RSD均＜9%（見表2），表明頭孢美唑鈉血漿樣品在室溫放置、冷凍儲(chǔ)存及反復(fù)凍融情況下均穩(wěn)定。

表2 頭孢美唑鈉血漿樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果（n＝5）Tab 2 Results of stability tests of cefmetazole sodium in plasma samples（n＝5）

2.9 臨床應(yīng)用

11名患者均為北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科2010年7－10月住院行剖宮產(chǎn)術(shù)的產(chǎn)婦。術(shù)前單次給予注射用頭孢美唑鈉2 g，靜脈滴注0.5 h，于給藥后不同時(shí)間點(diǎn)取臍帶血于抗凝管中，用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定臍帶血中頭孢美唑鈉濃度，結(jié)果見表3。

表3 11例剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦取血時(shí)間及血藥濃度Tab 3 Blood sampling time and plasma concentration in 11 patients with cesarean section

3 討論

3.1 測(cè)定方法的優(yōu)化

本研究建立了測(cè)定人血漿中頭孢美唑鈉濃度的HPLC法，并進(jìn)行了系統(tǒng)的方法確證，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定性良好，符合生物樣品分析的要求。

在建立本定量分析方法時(shí)，本研究對(duì)流動(dòng)相的pH值、流動(dòng)相組成的比例、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)等分析條件進(jìn)行了優(yōu)化。流動(dòng)相醋酸銨和甲醇的比例為85∶15，醋酸銨pH值為6.0，此結(jié)果是在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[3～7]，通過測(cè)定組分的不同比例，并以醋酸調(diào)節(jié)其pH值，考察其不同條件下目標(biāo)成分及內(nèi)標(biāo)的峰形和保留時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化而得。另外分別測(cè)定了頭孢美唑鈉在213、254、273 nm波長(zhǎng)下的紫外吸收情況，為最大限度地提高其響應(yīng)值，最終選定273 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究建立的方法操作簡(jiǎn)便、回收率高、專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、快速，為檢測(cè)頭孢美唑鈉的血藥濃度提供了簡(jiǎn)單可行的方法，還可用于頭孢美唑鈉的治療藥物監(jiān)測(cè)和藥動(dòng)學(xué)的研究。

3.2 臨床應(yīng)用

剖宮產(chǎn)切口屬于Ⅱ類切口，手術(shù)主要感染病菌為革蘭陰性桿菌，多使用第2代頭孢菌素。頭孢美唑鈉療效與第2代頭孢菌素類似，且具有頭孢菌素類藥物抗菌譜較廣、療效肯定、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)[8]。

研究表明[9]，健康成年人靜脈滴注注射用頭孢美唑鈉1 g 1 h后，血藥濃度在滴注結(jié)束時(shí)達(dá)峰值，峰平均值為76.2 μg·mL－1，6 h后為2.7 μg·mL－1，血藥濃度半衰期為1.2 h左右，藥物濃度和給藥劑量成正相關(guān)。另有一項(xiàng)由高瀨善次郎等[8]進(jìn)行的靜脈注射1 g頭孢美唑鈉后30 min～6 h測(cè)定母血和臍帶血濃度研究中，母體血清中的藥物濃度在給藥后30 min達(dá)峰，平均峰值為98 μg·mL－1；臍帶血清在2 h后達(dá)峰，峰值為12.25 μg·mL－1。表明母體血清和臍帶血清中的藥物濃度達(dá)峰時(shí)間存在1.5 h的時(shí)間差，從峰值的比率來(lái)看，母體血清濃度有12.5%滲透至臍帶血清中。

本項(xiàng)研究中頭孢美唑鈉給藥劑量為2 g，滴注時(shí)間為30 min。剖宮產(chǎn)術(shù)時(shí)胎兒娩出時(shí)間普遍為開始用藥后的15～20 min，此時(shí)臍帶血中頭孢美唑鈉濃度約為10～16 μg·mL－1。與文獻(xiàn)相比，血藥濃度僅相當(dāng)于母體濃度的7%～10%。從11例剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦不同時(shí)間點(diǎn)所取血測(cè)得的結(jié)果可以看出（見表3），臍帶血中的頭孢美唑鈉濃度大約在45 min～1 h左右達(dá)到峰值，約23～25 μg·mL－1。因藥物濃度與給藥劑量成正相關(guān)，此結(jié)果與文獻(xiàn)中給予1 g藥物靜脈滴注時(shí)的峰濃度值12.25 μg·mL－1一致，約相當(dāng)于母體血峰值的12%。還需注意的是，嚴(yán)重腎功能損害者可能會(huì)出現(xiàn)血藥濃度升高、半衰期延長(zhǎng)。本項(xiàng)研究中的患者腎功能均無(wú)異常，而對(duì)于腎功能不全的剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦要慎重用本藥，適當(dāng)調(diào)節(jié)給藥劑量和間隔。

雖然頭孢美唑鈉被證實(shí)是一種療效較好的藥物，尤其是其對(duì)β-內(nèi)酰胺酶有很好的穩(wěn)定性[10，11]，然而隨著耐藥性革蘭陰性桿菌的逐漸增加，有必要進(jìn)行更加深入的臨床研究，以確立本藥對(duì)新生兒和產(chǎn)婦的安全性。

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