王先裕 于分弟 梁聰耀 李良劭 黃維娜 杜永臣 劉政國 曾東 潘立凡

（1廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2融安縣經(jīng)濟(jì)作物推廣站，廣西 柳州 545400；3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；4廣西壯族自治區(qū)政府，廣西 南寧 530012；5南寧市青秀區(qū)農(nóng)林水利局，廣西 南寧 530213；6國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系桂林綜合試驗(yàn)站，廣西 桂林 541004）

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是較早利用雜種優(yōu)勢的蔬菜作物之一，一代雜種較常規(guī)品種產(chǎn)量提高20 %～30 %。利用雄性不育系不但減少了去雄這個(gè)繁雜的工序，而且降低了授粉難度，提高了育種效率，有效地保證了種子純度。雄性不育系已在多種作物育種中發(fā)揮了巨大的作用，因此，對不育系的尋找、探索成為研究者不斷努力的方向。

對不育機(jī)理的研究已有很多報(bào)道。對高粱（傅鴻儀，1983）、T型小麥（藤曉月和陳雪暉，1996）不育系和保持系的苗期葉片和幼穗期葉片的研究表明與育性相關(guān)的蛋白不在葉片中表達(dá)。Zhang和Chen（2001）用SDS-PAGE電泳直接檢測了莖用芥菜胞質(zhì)雄性不育系花器中特異蛋白質(zhì)的表達(dá)。陳蕊紅等（2009）研究推測不育系（S）-1376A雄性不育性可能與物質(zhì)能量代謝、細(xì)胞程序化死亡及花發(fā)育調(diào)控等生理生化代謝有關(guān)。Sheoran等（2009）研究表明番茄細(xì)胞絨氈層的推后或提前降解都會導(dǎo)致雄性不育，而且在 7B-1中幾種蛋白質(zhì)的表達(dá)很可能影響花粉發(fā)育。

高溫可使番茄花粉減少，而且隨著高溫時(shí)間的延長，花粉的減少量也增加，不育度也增強(qiáng)，尤其夜溫對不育性的影響較大（Peet & Batholomew，1996；Pressman et al.，2002）。Singh和Sawhney（1998）研究發(fā)現(xiàn)，低溫可使番茄 sl－2的育性恢復(fù)。陳麗等（2009）對番茄溫敏型功能型雄性不育生理機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)影響材料T431花柱伸長、育性轉(zhuǎn)換的最敏感時(shí)期為花芽分化期，即兩葉一心期，最敏感的溫度為18 ℃/10 ℃（晝/夜）。

本試驗(yàn)主要從花粉發(fā)芽率、自交結(jié)實(shí)率、果實(shí)種子數(shù)及葉片和花藥蛋白質(zhì)差異的角度，探求溫敏型雄性不育系番茄T4育性轉(zhuǎn)換的臨界溫度，同時(shí)研究影響T4表現(xiàn)為不育的外在表現(xiàn)及內(nèi)在機(jī)理，為番茄育種開拓新的可利用資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為溫敏型核雄性不育系番茄T4和對照可育系First，均由日本岡山大學(xué)農(nóng)學(xué)部作物繁殖研究室桝田正治教授提供。T4為原種First經(jīng)γ射線輻照后所得的變異突變體，夜溫在20 ℃以上時(shí)，T4表現(xiàn)出穩(wěn)定的雄性不育性；夜溫在20 ℃以下時(shí)，T4可恢復(fù)部分育性（Masaharu & Ojiewo，2006）。T4和對照First于 2009年8月～2010年4月種于廣西大學(xué)實(shí)驗(yàn)樓人工培養(yǎng)箱中。

1.2 試驗(yàn)方法

采用3臺人工氣候箱分別設(shè)定3個(gè)相同晝溫為28 ℃、不同夜溫（12、18、24 ℃）的處理，每天光照12 h（7：00～19：00）。幼苗3片真葉時(shí)，選擇生長狀況良好且長勢相似的3株First和9株T4，分別移入3臺人工氣候箱中，每臺氣候箱種植1株First及3株T4，水肥管理一致。至開花期，采集當(dāng)天開放的花朵，取其花粉在25 ℃條件下培養(yǎng)2 h，調(diào)查花粉發(fā)芽率；采集生殖生長期的第2或第3片功能葉及當(dāng)天開放的花，在-80 ℃下保存，用于進(jìn)行蛋白質(zhì)差異性分析；于果實(shí)成熟期，統(tǒng)計(jì)前3果穗自交結(jié)實(shí)率和果實(shí)種子數(shù)。

蛋白質(zhì)提取方法：將備用的各處理番茄葉片、花藥分別稱取0.2 g和0.1 g，在冰浴條件下用樣品蛋白質(zhì)提取液迅速研磨，磨成勻漿后倒入5 mL離心管中（放置冰盒中），然后于4 ℃冷凍條件下5000 r·min-1離心20 min。離心后取上層清液，分裝并貼好標(biāo)簽，存于-80 ℃冰箱待用。電泳方法：Tricine-SDS-PAGE測定低分子量蛋白質(zhì)法（胡天橋，2009）。電泳儀器：Power Pac HCTW電泳儀、Mini Protean 3well垂直電泳槽。

遷移率（R）=蛋白質(zhì)遷移的距離/溴酚藍(lán)遷移的距離

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS6.55軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度處理對T4花粉發(fā)芽率、自交結(jié)實(shí)率及果實(shí)種子數(shù)的影響

由表1可知，28 ℃/24 ℃和28 ℃/12 ℃處理的T4花粉發(fā)芽率分別為26.9 %和30.1 %，極顯著低于對照；而28 ℃/18 ℃處理的T4花粉發(fā)芽率為54.3 %，與對照差異不顯著。表明28 ℃/18 ℃處理的T4花粉活性強(qiáng)，而其他兩個(gè)溫度處理的T4花粉活性弱，說明T4具有溫敏特性；夜溫為18 ℃時(shí)T4和對照的花粉發(fā)芽率最高，分別為54.3 %和63.1 %，此時(shí)T4恢復(fù)部分育性。

自交結(jié)實(shí)率除了28 ℃/18 ℃處理的T4和對照差異不顯著外，其他兩個(gè)處理T4與對照都達(dá)到極顯著差異水平，與花粉發(fā)芽率表現(xiàn)一致。表明高夜溫影響花粉活力，最終表現(xiàn)為影響自交結(jié)實(shí)率；夜溫為18 ℃的T4恢復(fù)部分育性，表現(xiàn)出高的自交結(jié)實(shí)率。

夜溫分別為24 ℃和12 ℃的處理T4的單果種子數(shù)都極顯著低于對照，說明T4在這兩個(gè)溫度下育性低，表現(xiàn)為不育，與自交結(jié)實(shí)率分析得到的結(jié)論一致，T4的最適夜溫為18 ℃。

花粉發(fā)芽率、自交結(jié)實(shí)率和果實(shí)種子數(shù)間均存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù) r1，2=0.99、r1、3=0.94、r2、3=0.98。表明當(dāng)花粉活性增高時(shí)，自交結(jié)實(shí)率提高，單果種子數(shù)也隨之增加。

表1 不同溫度處理對T4花粉發(fā)芽率、自交結(jié)實(shí)率及果實(shí)種子數(shù)的影響

2.2 Tricine-SDS-PAGE蛋白凝膠電泳分析

圖1 Tricine-SDS-PAGE蛋白凝膠電泳圖

由圖1和表2可知，夜溫為18 ℃的處理T4花藥中蛋白質(zhì)譜帶較夜溫為24 ℃的處理少了D位點(diǎn)的譜帶，較夜溫為12 ℃的處理少了D、E位點(diǎn)的譜帶；但多了B位點(diǎn)的譜帶。此外，在C位點(diǎn)，夜溫為 18 ℃的處理 T4譜帶較其他兩個(gè)溫度處理明顯存在量上的差異。因材料遺失，缺失了對照 First的花藥譜帶。對照的葉片蛋白質(zhì)譜帶沒有什么差異，僅C位點(diǎn)上表現(xiàn)出量上的稍微差異。而不同溫度處理的T4葉片蛋白質(zhì)譜帶間存在差異，夜溫為18 ℃的處理較其他兩個(gè)溫度處理少了I位點(diǎn)的譜帶。說明不同器官蛋白質(zhì)存在差異，即使在同一器官，不同的處理也會存在差異。T4在可育和不育條件下，不僅在花粉發(fā)芽率和自交結(jié)實(shí)率上存在差異，在蛋白質(zhì)表達(dá)上也存在差異。

表2 差異蛋白質(zhì)的相對遷移率及其蛋白質(zhì)分子量

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)主要從夜溫不同的角度剖析番茄T4育性的臨界溫度，試驗(yàn)結(jié)果表明夜溫的臨界溫度在18 ℃左右。夜溫為12 ℃與24 ℃時(shí)，T4的花粉發(fā)芽率、自交結(jié)實(shí)率及果實(shí)種子數(shù)均不存在顯著性差異，但與對照First之間存在極顯著性差異，此時(shí)T4表現(xiàn)為雄性不育，可用于制種。當(dāng)夜溫為18 ℃時(shí)，T4的花粉發(fā)芽率、自交結(jié)實(shí)率及果實(shí)種子數(shù)與對照差異不顯著，此時(shí)T4恢復(fù)部分育性。表明番茄T4不育表現(xiàn)受夜溫影響，但在夜溫12 ℃和24 ℃下的T4表現(xiàn)出來的不育機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

對番茄蛋白質(zhì)方面的研究尚鮮見報(bào)道，武晗等（2009）對幾種小麥雄性不育系育性敏感時(shí)期的蛋白質(zhì)含量變化進(jìn)行了研究，結(jié)果表明旗葉小穗發(fā)育的單核期和二核期均為育性發(fā)育的敏感時(shí)期，該時(shí)期可以檢測到特異蛋白的存在，說明該特異蛋白極有可能是與育性相關(guān)的或者育性發(fā)育所必須的。

本試驗(yàn)電泳結(jié)果顯示，番茄核雄性不育系T4的葉片蛋白質(zhì)和花藥蛋白質(zhì)譜帶與對照都存在差異，該結(jié)論與曾維英等（2008）得到大豆雄性不育系與保持系花藥 2-DE圖譜間存在較多差異蛋白點(diǎn)、種子間僅有少量差異表達(dá)蛋白點(diǎn)、而葉片間基本上沒有差異表達(dá)蛋白點(diǎn)存在不同，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

陳麗，譚麗麗，王勇.2009.番茄溫敏型功能雄性不育生理機(jī)制的初步研究.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，40（1）：31-35.

陳蕊紅，葉景秀，張改生，王俊生，牛娜，馬守才，趙繼新，朱建楚.2009.小麥質(zhì)核互作型雄性不育系及其保持系花藥差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，36（4）：431-440.

傅鴻儀.1983.高粱線粒體基因組的翻譯產(chǎn)物與細(xì)胞質(zhì)雄性不育性.遺傳學(xué)報(bào)，10（6）：471-476.

胡天橋.2009.肺結(jié)核患者血清小分子標(biāo)志蛋白分離鑒定的初步研究〔碩士論文〕.廣西：廣西醫(yī)科大學(xué).

藤曉月，陳雪暉.1996.小麥T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系蛋白質(zhì)的比較研究.作物學(xué)報(bào)，22（3）：264-270.

武晗，馬翎健，何蓓如，李薇，靳鳳，王愛芳.2009.幾類小麥雄性不育系育性敏感時(shí)期蛋白質(zhì)含量的變化.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，18（3）：94-96.

曾維英，楊守萍，喻德躍，蓋鈞鎰.2008.大豆雄性不育系與其保持系不同器官蛋白質(zhì)比較.西北植物學(xué)報(bào)，28（8）：1619-1624.

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