鄭美梅，王方劍，溫武金，江 勇，段成城，潘小華（廣州醫(yī)學院附屬深圳沙井醫(yī)院呼吸內(nèi)科，深圳市 518104）

氣道重塑是支氣管哮喘的重要病理特征之一[1]，是哮喘難以控制的一個重要原因。近年來，隨著研究的深入，抑制和逆轉(zhuǎn)氣道重塑成為哮喘治療的新方向。研究[2]發(fā)現(xiàn)，阿奇霉素可抑制炎癥介質(zhì)釋放，減少黏液分泌，降低氣道高反應(yīng)，減輕哮喘臨床癥狀，但能否抑制或逆轉(zhuǎn)氣道重塑尚不清楚。本課題通過復(fù)制哮喘模型小鼠，觀察阿奇霉素對其氣道上皮細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達及氣道重塑指標的影響，為其在哮喘的臨床治療方面提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YC-Y800超聲霧化治療儀（北京亞都科技股份有限公司）；TDL高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；石蠟切片機（美國Optical公司）；光學顯微及照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）；DC200圖像采集及分析系統(tǒng)（德國Leica公司）。

1.2 試藥

注射用乳糖酸阿奇霉素（以下簡稱阿奇霉素，哈藥集團制藥總廠，批號:B100501213，規(guī)格:每支0.25 g）；卵蛋白（美國Sigma公司分裝，批號:A5253）；氫氧化鋁（廣州化學試劑廠，批號:20100302，分析純）；地塞米松片（廣東江門制藥廠，批號:100502，規(guī)格:每片0.75 mg）；兔抗鼠MMP-9多克隆抗體及即用型免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 動物

BALB/c小鼠60只，SPF級，♂，8～10周齡，體重（20±3）g，由廣州醫(yī)學院動物實驗中心提供，合格證號:2010A015。

2 方法

2.1 分組與給藥

取小鼠60只，隨機分為正常對照組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽性對照組（地塞米松，0.18 mg·mL－1）和阿奇霉素低、中、高劑量組（0.2、0.4、0.8 mg·mL－1），每組10只。除正常對照組外其余各組均腹腔注射0.2 mL抗原液（卵蛋白10 μg、氫氧化鋁20 mg配成100 mL），每隔2周注射1次，共3次；第3次注射1周后每天上午霧化卵蛋白30 min以激發(fā)哮喘，每日1次，連續(xù)15 d。模型組小鼠出現(xiàn)呼吸頻率加快、點頭呼吸、鼻翼煽動、抽搐等癥狀時示造模成功。每日霧化前1 h腹腔注射相應(yīng)藥物0.5 mL。阿奇霉素及地塞米松的用藥劑量是將成人臨床用藥量按小鼠體表面積進行換算，得實驗小鼠用藥劑量為10 mg·kg－1·d－1；阿奇霉素低、中、高劑量組分別相當于臨床擬定治療劑量的20、10、5倍。

2.2 肺組織病理學變化

末次激發(fā)24 h后，處死小鼠取左肺組織，置于10%的中性甲醛溶液中，固定24 h后進行脫水，石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化。同時右肺組織切片后擬行免疫組化處理。

2.3 氣道重塑指標的檢測

左肺組織切片行HE染色后，400倍光鏡下觀察肺組織病理學改變。200倍光鏡下選擇20個完整的支氣管橫斷面，圖像分析軟件測量基底膜周徑（Pbm）、支氣管總管壁面積（WAt）、氣道內(nèi)壁面積（WAi）、平滑肌面積（WAm），用Pbm將測量值標準化（以消除管徑大小、氣道狀態(tài)以及切片方向不同等所造成的差別），分別代表總管壁厚度（WAt/Pbm）、內(nèi)壁厚度（WAi/Pbm）、平滑肌厚度（WAm/Pbm），來衡量氣道重塑程度。

2.4 氣道上皮細胞MMP-9表達的檢測

采用免疫組化染色法，參照二抗試劑盒說明書進行操作，取右肺組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液微波加熱修復(fù)，一抗稀釋度為1∶100，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照，中性樹膠封片觀察。400倍光鏡下，每張切片隨機取5個支氣管，用圖像分析軟件測量各組支氣管上皮細胞胞漿中MMP-9陽性表達產(chǎn)物的平均光密度（OD）值，表示支氣管上皮細胞MMP-9表達的相對含量。

2.5 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 小鼠哮喘發(fā)作情況

末次激發(fā)后30 min內(nèi)，除正常對照組外其余各組小鼠均出現(xiàn)呼吸頻快、躁動、打噴嚏等癥狀；模型組癥狀重且持續(xù)時間長，嚴重者出現(xiàn)行動遲緩、食欲下降；陽性對照組和阿奇霉素各劑量組發(fā)作程度均較輕。

3.2 肺組織病理學變化

與正常對照組比較，模型組小鼠氣道管腔狹窄，可見黏液栓堵塞，黏膜下層增寬，黏膜皺褶增多呈菊花狀，氣道壁及氣道平滑肌層明顯增厚，氣道上皮細胞脫落，杯狀細胞增多，黏膜下及管周可見有大量炎性細胞浸潤；而陽性對照組和阿奇霉素各劑量組上述病變較模型組均減輕。各組小鼠肺組織病理學變化見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理學變化（HE，×400）A.正常對照組；B.模型組；C.阿奇霉素低劑量組；D.阿奇霉素中劑量組；E.阿奇霉素高劑量組；F.陽性對照組Fig 1 Histopathological changes of mice lung in each group（HE，×400）A.normal control group；B.model group；C.azithromycin low-dose group；D.azithromycin medium-dose group；E.azithromycin high-dose group；F.positive control group

3.3 氣道重塑指標比較

與模型組比較，陽性對照組和阿奇霉素各劑量組WAt/Pbm、WAi/Pbm、WAm/Pbm 3個指標均明顯下降（P＜0.01），但仍顯著高于正常對照組（P＜0.01）。各組小鼠氣道重塑指標結(jié)果比較見表1。

表1 各組小鼠氣道重塑指標結(jié)果比較（μm2·μm－1，，n＝10）Tab 1 Comparison of airway remodeling index of mice in each grou（pμm2·μm－1，，n＝10）

表1 各組小鼠氣道重塑指標結(jié)果比較（μm2·μm－1，，n＝10）Tab 1 Comparison of airway remodeling index of mice in each grou（pμm2·μm－1，，n＝10）

與正常對照組比較:＊P＜0.01；與模型組比較:#P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.01

組別正常對照組模型組阿奇霉素低劑量組阿奇霉素中劑量組阿奇霉素高劑量組陽性對照組WAm/Pbm 3.94±0.437.97±0.17＊5.47±0.16＊#4.75±0.35＊#4.56±0.14＊#4.39±0.34＊#WAt/Pbm 7.15±0.8315.36±0.85＊11.80±0.30＊#10.15±0.95＊#9.87±0.12＊#8.23±0.62＊#WAi/Pbm 3.40±0.4310.64±1.03＊5.21±0.57＊#4.16±0.32＊#4.08±0.27＊#3.94±0.31＊#

3.4 MMP-9表達比較

正常對照組MMP-9在氣道黏膜上皮細胞胞漿中有少量表達或不表達；模型組MMP-9在上皮細胞胞漿中呈強陽性表達，為棕色顆粒；陽性對照組和阿奇霉素各劑量組較模型組表達均減弱，顏色變淺。各組小鼠氣道上皮細胞MMP-9免疫組化染色結(jié)果見圖2，MMP-9表達比較見表2。

圖2 各組小鼠氣道上皮細胞MMP-9免疫組化染色結(jié)果（DAB，×400）A.正常對照組；B.模型組；C.阿奇霉素低劑量組；D.阿奇霉素中劑量組；E.阿奇霉素高劑量組；F.陽性對照組Tab 2 Immunohistochemical staining of airway epithelial cells MMP-9（DAB，×400）A.normal control group；B.model group；C.azithromycin low-dose group；D.azithromycin medium-dose group；E.azithromycin high-dose group；F.positive control group

表2 各組小鼠氣道上皮細胞MMP-9表達比較（，n＝10）Fig 2 Comparison of MMP-9 expression of airway epithelial cells of mice in each grou（p，n＝10）

表2 各組小鼠氣道上皮細胞MMP-9表達比較（，n＝10）Fig 2 Comparison of MMP-9 expression of airway epithelial cells of mice in each grou（p，n＝10）

與正常對照組比較:＊P＜0.05；與模型組比較:#P＜0.05vs.normal control group:＊P＜0.05；vs.model group:#P＜0.05

組別正常對照組模型組阿奇霉素低劑量組阿奇霉素中劑量組阿奇霉素高劑量組陽性對照組光密度值0.76±0.161.75±0.05＊1.42±0.83＊#1.34±0.03＊#1.28±0.15＊#0.98±0.17＊#例數(shù)101010101010

4 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)代謝的主要限速酶，與哮喘氣道重塑密切相關(guān)[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）是MMP-9的生理性特異抑制劑，正常時二者以1∶1的形式分泌，MMP-9/TIMP-1比值升高會導(dǎo)致組織損傷。研究[4，5]發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的肺泡灌洗液、血清及痰中的MMP-9水平明顯升高，黏膜下MMP-9 mRNA和蛋白表達也升高。哮喘急性發(fā)作期MMP-9占優(yōu)勢，不僅導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的降解和沉積紊亂，還可誘導(dǎo)以嗜酸粒細胞為主的白細胞的遷移[5]及平滑肌細胞的增殖與肥大[6]，進而引起氣道重塑。因此，抑制MMP-9的過度表達成為治療哮喘特別是難治性哮喘的重要研究方向。

本研究結(jié)果表明，阿奇霉素可能通過下調(diào)MMP-9的表達，延緩氣道重塑的病理變化，從而減慢哮喘氣道重塑的進程，但效果較地塞米松仍較弱。

[1]Holgate ST，Peters-Golden M，Jpanettieri RA，et al.Roles of cysteinyl leukotrienes in airway inflammation，smooth muscle function，and remodeling[J].J Allergy Clin Immunol，2003，111（Suppl 1）:S18.

[2]Piacentini GL，Peroni DG，Bodini A，et al.Azithromycin reduces bron-chial hyperresponsiveness and neutrophilic airway inflammation in asthmatic children:a preliminary report[J].Allergy Asthma Proc，2007，28（2）:194.

[3]王家珍，吳天清，周立遠.Egb761對哮喘模型大鼠MMP-9及TIMP-1表達的影響和對氣道重構(gòu)的干預(yù)研究[J].中國藥房，2008，19（24）:1845.

[4]Lee YC，Lee HB，Rhee YK，et al.The involvement of matrix metalloproteinase-9 in airway inflammation of patients with acute asthma[J].Clin Exp Allergy，2001，31（10）:1623.

[5]Atkinson JJ，Senior RM.Matrix metalloproteinase-9 in lung remodeling[J].Am J Respir Cell Mol Bio，2003，28（1）:12.

[6]Borger P，Tamm M，Black JL，et al.Asthma:is it due to an abnormal airway smoothmuscle cell？[J].Am J Respir Crit Care Med，2006，174（4）:367.