湯召兵，茍 欣，王 明，何衛(wèi)陽，劉朝東，鄧遠(yuǎn)忠，李 杰，陳 勇，任 軻（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，重慶市 400016）

鋁在環(huán)境中大量存在，故人的一生中暴露于鋁是不可避免的。在日常生活中，鋁經(jīng)過飲水、食物等被人體吸收，尤其對于特殊人群如鋁從業(yè)者、長期使用含鋁的藥物及化妝品者，則增加了其鋁的攝入量。鋁在體內(nèi)聚積可引起人類多種疾病，如透析性癡呆、老年性癡呆、非缺鐵性小紅細(xì)胞性貧血、軟骨病等[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，氯化鋁（AlCl3）對動(dòng)物具有胚胎毒性，可致畸胎形成。食入過多的鋁可使其在靶器官內(nèi)聚積，對人及動(dòng)物的睪丸組織均有損害作用。精子的存活率和活動(dòng)率都與體內(nèi)精子及精漿中含鋁的濃度相關(guān)，鋁的濃度越高，精子存活率和活動(dòng)率越低。但在體外試驗(yàn)中，有關(guān)鋁的生殖毒性的研究文獻(xiàn)報(bào)道還較少，Yousef等[3]證實(shí)在體外，鋁同樣具有生殖毒性作用。美洛昔康為新一代非甾體類抗炎藥，具有顯著而持久的抗炎作用及一定的止痛、解熱作用，安全性、耐受性好，已在臨床廣泛使用。美洛昔康在臨床上使用的常規(guī)劑量為每日15 mg，其副作用較少，主要表現(xiàn)為胃腸道反應(yīng)，也有少數(shù)出現(xiàn)過敏反應(yīng)。有研究[4]證實(shí)，美洛昔康對鋁所致的神經(jīng)系統(tǒng)損害也具有顯著的保護(hù)作用。本文通過體外試驗(yàn)研究AlCl3對人精子的毒性作用及美洛昔康對其的干預(yù)作用，以期為臨床應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

WLJY-2008型電腦自動(dòng)精液采集分析儀（北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司）；CX21顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試藥

美洛昔康片（昆山龍燈瑞迪制藥有限公司，批號:070502，規(guī)格:每片15 mg）；六水三氯化鋁（AlCl3·6H2O）（大連雪源精細(xì)化工有限公司，國產(chǎn)分析純）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）檢測試劑盒（北京北化康泰臨床試劑有限公司）。

1.3 精液

收集健康男性（年齡25～35歲）精液標(biāo)本，經(jīng)分析各項(xiàng)指標(biāo)均符合世界衛(wèi)生組織（WHO）相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，其中精液量≥3 mL，精子濃度≥50×106個(gè)/mL，活動(dòng)率≥70%，共收集精液標(biāo)本5份。

2 方法

2.1 溶液的制備

取AlCl3·6H2O，加蒸餾水稀釋制成濃度分別為5、10、15 mol·L－1的AlCl3溶液。另取美洛昔康片，精密稱定，碾磨成粉，加蒸餾水稀釋制成濃度為1×10－5mol·L－1的美洛昔康溶液。

2.2 分組處理

精液標(biāo)本放置于37℃水浴箱中，液化后，每份精液作如下處理:用精子營養(yǎng)液將精液稀釋至1×106個(gè)/mL，調(diào)節(jié)pH為7，然后均分為8份，4份為1組，每組4個(gè)亞組，第1組為對照組（生理鹽水）和AlCl3低、中、高劑量組（5、10、15 mol·L－1），每組加入相應(yīng)藥物；第2組在第1組的基礎(chǔ)上，除對照組改為加入美洛昔康1×10－5mol·L－1外，其余3組均預(yù)先加入美洛昔康1×10－5mol·L－1。

2.3 精子存活率與活動(dòng)率的檢測

以加入AlCl3后開始計(jì)時(shí)，在37℃水浴箱中培育0、2、4 h后檢測精子的存活率及活動(dòng)率。用0.5%伊紅染色，光鏡下觀察著色的為死精子，未著色的為活精子，存活率（%）＝未著色精子數(shù)量/總精子數(shù)量×100%。精子活動(dòng)率使用電腦自動(dòng)精液采集分析儀進(jìn)行檢測。

2.4 精漿中SOD及AST的檢測

取“2.3”項(xiàng)下各時(shí)間點(diǎn)的精漿，按試劑盒使用說明書檢測其中SOD和AST活性。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 精子存活率與活動(dòng)率檢測結(jié)果

與相同時(shí)間點(diǎn)對照組比較，隨AlCl3濃度增加，精子存活率與活動(dòng)率均降低（P＜0.05或P＜0.01），呈濃度依賴性；但當(dāng)Al-Cl3濃度為5 mol·L－1時(shí)，作用0、2 h時(shí)精子存活率降低無明顯變化（P＞0.05），即對精子未產(chǎn)生明顯毒性作用。與第1組相同濃度及時(shí)間點(diǎn)比較，AlCl3中、高劑量組作用2、4 h時(shí)上述指標(biāo)均有升高（P＜0.05或P＜0.01）。各組精子存活率比較見表1，活動(dòng)率比較見表2。

表1 各組精子存活率比較（%%，，n＝5）Tab 1 Comparison of survival rate of sperm（%%，，n＝5）

表1 各組精子存活率比較（%%，，n＝5）Tab 1 Comparison of survival rate of sperm（%%，，n＝5）

與相同時(shí)間點(diǎn)對照組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與第1組相同濃度及時(shí)間點(diǎn)比較:#P＜0.05；與相同濃度作用0 h組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01vs.control group at same time point:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the first group with same concentration at same time:#P＜0.05；vs.that group with same concentration treated for 0 h:△P＜0.05，△△P＜0.01

表2 各組精子活動(dòng)率比較（%%，，n＝5）Tab 2 Comparison of activity ratio of sperm（%%，，n＝5）

表2 各組精子活動(dòng)率比較（%%，，n＝5）Tab 2 Comparison of activity ratio of sperm（%%，，n＝5）

與相同時(shí)間點(diǎn)對照組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與第1組相同濃度及時(shí)間點(diǎn)比較:#P＜0.05，##P＜0.01；與相同濃度作用0 h組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01vs.control group at same time point:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the first group with same concentration at same time:#P＜0.05，##P＜0.01；vs.that group with same concentration treated for 0 h:△P＜0.05，△△P＜0.01

3.2 精漿中SOD活性變化

與相同時(shí)間點(diǎn)對照組比較，AlCl3高劑量組SOD活性明顯降低（P＜0.05）。與第1組相同濃度及時(shí)間點(diǎn)比較，AlCl3高劑量組SOD活性明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。各組精漿中SOD活性比較見表3（表中數(shù)據(jù)為實(shí)測值×精液稀釋倍數(shù)）。

3.3 精漿中AST活性變化

與相同時(shí)間點(diǎn)對照組比較，第1組中作用2、4 h時(shí)AlCl3低、中、高劑量組AST活性幾乎全部明顯增強(qiáng)，第2組作用4 h時(shí)AlCl3中、高劑量組AST活性明顯增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01）。與第1組相同濃度及時(shí)間點(diǎn)比較，第2組作用4 h時(shí)Al-Cl3中、高劑量組AST活性明顯減弱（P＜0.05）。各組精漿中AST活性比較見表4（表中數(shù)據(jù)為實(shí)測值×精液稀釋倍數(shù)）。

4 討論

精子濃度、精子活動(dòng)率及存活率是評判精子質(zhì)量及生育力最重要的參數(shù)，處在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的人或動(dòng)物，其精漿和血漿中的氧自由基明顯增加，產(chǎn)生過氧化作用從而損傷細(xì)胞膜、DNA及亞細(xì)胞器膜，進(jìn)而對細(xì)胞功能產(chǎn)生顯著的不利影響，使精子質(zhì)量明顯下降而致不育。SOD是精液中最重要的抗氧化防御劑，其活性高低可作為男性不育的判斷指標(biāo)之一。有研究[5，6]提示，精漿中SOD活性低可作為診斷男性不育的參數(shù)之一。

有研究[7，8]證實(shí)，在體外、內(nèi)鋁均顯示出氧化作用，能促進(jìn)生物氧化。在本研究中，一定濃度的AlCl3加入精液中孵育一定時(shí)間后（濃度為15 mol·L－1、時(shí)間≥2 h），精子活動(dòng)率及存活率明顯降低、SOD活性明顯受到抑制，且與AlCl3濃度及孵育時(shí)間具有明顯的依賴性，與Yousef等[3]研究報(bào)道結(jié)果一致。AST在精子代謝轉(zhuǎn)氨過程中有著重要作用。在本研究中，AlCl3增強(qiáng)了AST活性，與有關(guān)文獻(xiàn)[3，8]結(jié)果相近，AST活性增強(qiáng)可能是由于線粒體某些結(jié)構(gòu)的改變從而引起AST漏出有關(guān):孵育時(shí)間越長，AlCl3濃度越高，線粒體結(jié)構(gòu)破壞越重，AST漏出越多；而在剛加入AlCl3時(shí)，線粒體結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生改變，雖然AlCl3濃度增加，AST活性卻無明顯變化。但文中其他3個(gè)指標(biāo)由于比較敏感，所以在剛加入AlCl3時(shí)就表現(xiàn)出了明顯的差異。

表3 各組精漿中SOD活性比較（U·mL－1，，n＝5）Tab 3 Comparison of SOD activity of sperm（U·mL－1，，n＝5）

表3 各組精漿中SOD活性比較（U·mL－1，，n＝5）Tab 3 Comparison of SOD activity of sperm（U·mL－1，，n＝5）

與相同時(shí)間點(diǎn)對照組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與第1組相同濃度及時(shí)間點(diǎn)比較:#P＜0.05，##P＜0.01；與相同濃度作用0 h組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01vs.control group at same time point:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the first group with same concentration at same time:#P＜0.05，##P＜0.01；vs.that group with same concentration treated for 0 h:△P＜0.05，△△P＜0.01

表4 各組精漿中AST活性比較（U·mL－1，，n＝5）Tab 4 Comparison ofAST activity of sperm（U·mL－1，，n＝5）

表4 各組精漿中AST活性比較（U·mL－1，，n＝5）Tab 4 Comparison ofAST activity of sperm（U·mL－1，，n＝5）

與相同時(shí)間點(diǎn)對照組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與第1組相同濃度及時(shí)間點(diǎn)比較:#P＜0.05；與相同濃度作用0 h組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01vs.control group at same time point:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the first group with same concentration at same time:#P＜0.05；vs.that group with same concentration treated for 0 h:△P＜0.05，△△P＜0.01

本研究結(jié)果表明，在體外，單純加入美洛昔康與生理鹽水比較，精子活動(dòng)率、存活率及精漿SOD、AST活性在相同孵育時(shí)間下均無明顯差異，表明美洛昔康在相近于臨床治療血藥濃度時(shí)，對精液質(zhì)量無明顯影響，即對生育力正常者，美洛昔康不會(huì)產(chǎn)生不利影響。但美洛昔康對AlCl3引起的精子毒性作用卻具有一定的保護(hù)作用，其可以減輕AlCl3對SOD活性的抑制作用、對AST活性的增強(qiáng)作用，精子活動(dòng)率及存活率也有部分增強(qiáng)，但不能完全改善，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，在體外試驗(yàn)中，AlCl3對人精液具有明顯毒性作用，并表現(xiàn)出時(shí)間及濃度依賴性，美洛昔康對其具有明顯的改善作用。

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