劉 斌，戚 峰，季 兵，鞏發(fā)才，劉 彤

大腸癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的前列，在全球呈上升趨勢(shì)[1-2]。我們通過收集本院2008年4月—2009年3月經(jīng)手術(shù)切除的60例大腸癌標(biāo)本，研究大腸癌淋巴管密度與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，并應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析大腸癌組織淋巴管生成的可能調(diào)控基因，為大腸癌的靶向治療提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 資料 本組共60例，男32例，女28例；年齡43～80歲，中位年齡67歲。根據(jù)腫瘤所在部位行相應(yīng)的腫瘤切除及淋巴結(jié)清掃。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。手術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療、生物治療等。

1.2 取材 標(biāo)本均采集大腸癌組織、遠(yuǎn)癌切端腸組織黏膜，標(biāo)本離體后取材并分為兩部分，一部分置入液氮速凍后再置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，另一部分置?0%中性福爾馬林固定后進(jìn)行石蠟包埋備用。

1.3 免疫組化染色及觀察方法 將手術(shù)切除標(biāo)本以抗Podoplanin抗體（Santa Cruz公司，1∶100稀釋）為一抗進(jìn)行免疫組化染色，按照Weidner等[3]報(bào)道的方法，先在低倍鏡(×40)下掃視整個(gè)視野的腫瘤區(qū)域，選擇其中的4個(gè)淋巴管密集區(qū)，然后在高倍鏡(×200)下計(jì)數(shù)其淋巴管數(shù)目，取其平均值作為該例標(biāo)本的LVD值。

1.4 基因芯片分析 將標(biāo)本以LVD為標(biāo)準(zhǔn)分為高密度和低密度兩組，每組隨機(jī)選取2例標(biāo)本。提取4個(gè)大腸癌組織樣本mRNA，制備生物素標(biāo)記的cRNA探針，與腫瘤基因芯片（OHS-802）雜交，采用化學(xué)熒光法檢測(cè)特異基因表達(dá)水平，最后行圖像采集與數(shù)據(jù)分析。芯片購(gòu)自上海康成生物工程有限公司，包含有腫瘤抑制基因、致癌基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體和血管生成因子基因等480個(gè)靶基因點(diǎn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS l5.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌組織和遠(yuǎn)癌切端大腸組織的LVD計(jì)數(shù)大腸癌組織的LVD為（17.72±6.93），遠(yuǎn)癌切端腸組織為（8.90±2.40），二者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜ 0.05)。

2.2 大腸癌組織LVD計(jì)數(shù)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系不同分化程度、不同浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)陽(yáng)性與陰性組的大腸癌組織LVD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，不同年齡、性別、組織學(xué)分型間的大腸癌組織LVD無(wú)明顯差異(P＞0.05），見表1。

表1 大腸癌組織LVD與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 腫瘤基因芯片檢測(cè) 大腸癌組織4例，其中A、B為大腸癌組織Podoplanin表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，其LVD水平較高，C、D為大腸癌組織Podoplanin表達(dá)弱陽(yáng)性，其LVD水平較低，見圖1。

圖1 腫瘤基因芯片掃描圖片

LVD表達(dá)高的大腸癌組織比LVD表達(dá)低的大腸癌組織上調(diào)5倍以上基因有:ERCC3,AXL,LEP,UCHL1,VEGF-A；而下調(diào)5倍以上的基因有:VHL,CDC20,MMP1,TFDP1,CDKN2A,RRM1,HMMR，KLK10,ABCB1,HSPA4,SLC1A4（見圖 2）

3 討論

圖2 聚類分析:A、B平均值/C、D平均值

常用的淋巴管識(shí)別技術(shù)包括淋巴管注射法、酶組織化學(xué)染色方法、電鏡技術(shù)、免疫組織化學(xué)方法等。免疫組織化學(xué)方法目前被認(rèn)為是鑒別淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，尤其是與血管內(nèi)皮細(xì)胞相鑒別的最佳方法。近年來對(duì)新生淋巴管的研究逐漸增多，主要是源于其特異性標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，最常用的包括Podoplanin、LYVE—1和VEGFR。郭嫦媛等[4]研究發(fā)現(xiàn)，免疫組織化學(xué)技術(shù)下Podoplanin染色可以作為標(biāo)記淋巴管的理想實(shí)驗(yàn)方法。本研究選取手術(shù)切除大腸癌標(biāo)本60例，同時(shí)取遠(yuǎn)癌切端腸組織作為對(duì)照，并采用抗Podoplanin抗體免疫組化進(jìn)行淋巴管密度的測(cè)定，證實(shí)大腸癌組織LVD顯著高于遠(yuǎn)癌切端腸黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示大腸癌中有大量淋巴管生成，與大多數(shù)研究的報(bào)道結(jié)果一致。同時(shí)，LVD與大腸癌患者的性別、年齡、組織學(xué)分型之間無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)，而與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤的分化程度明顯相關(guān)。大腸癌中LVD在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示淋巴管數(shù)量的多少與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。大腸癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度是臨床上反映腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，本研究顯示腫瘤的淋巴管密度與大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，說明腫瘤的淋巴管密度在腫瘤的惡性進(jìn)展過程中起著重要的促進(jìn)作用。

大腸癌尤其是伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，術(shù)后輔助化療已成為常規(guī)。但是對(duì)于淋巴結(jié)尚無(wú)轉(zhuǎn)移的患者是否需要化療仍無(wú)統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。蘇木精-伊紅染色病理檢查未發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Dukes-A和Dukes-B期病人，仍有10%～25%于術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)[5]，提示存在著一種常規(guī)手段不易發(fā)現(xiàn)的腫瘤“微轉(zhuǎn)移”。從本研究中得出，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組與陰性組之間LVD有顯著差異。但是，大腸癌手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng)Podoplanin免疫組化染色，檢測(cè)腫瘤組織中淋巴管數(shù)目是否可以作為篩選此類患者的手段有待進(jìn)一步研究。

眾所周知，大腸癌的發(fā)生為一多步驟、多階段過程，涉及多個(gè)基因的改變。目前普遍認(rèn)為，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在血管和淋巴管生成中具有直接和間接的調(diào)控作用,及時(shí)地抑制VEGF能夠阻止疾病的進(jìn)展[6]，VEGF-A是大部分腫瘤和組織血管生成的關(guān)鍵因子[7]。Damert等[8]報(bào)道，VEGF-A在腫瘤組織中同樣可以引起淋巴管的生成。Meit等[9]證明，VEGF-A是通過VEGF-C/-D/VEGFR-3這一通路促進(jìn)淋巴管的生成，而且促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。VEGF-A可能是腫瘤生長(zhǎng)中最常見的上調(diào)因子，因此它可能是最常見的實(shí)體腫瘤中淋巴生成因子促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移的因子。貝伐珠單抗注射液是VEGF抑制劑，近年研究表明在化療的基礎(chǔ)上加用此藥，通過與VEGF特異性結(jié)合，阻止其與受體相互作用，發(fā)揮對(duì)腫瘤的多種抑制作用，能更進(jìn)一步提高晚期大腸癌的有效率和總生存期。本研究顯示VEGF-A是LVD表達(dá)高的大腸癌組織比LVD表達(dá)低的大腸癌組織上調(diào)5倍以上基因之一。

林希病腫瘤因子（von hippel-lindua,VHL）是公認(rèn)的缺氧誘導(dǎo)因子的抑制因子，與HIF-1a有著復(fù)雜的相互作用，并調(diào)控其降解。VHL基因最早是作為腫瘤抑制基因被發(fā)現(xiàn)的，近年研究發(fā)現(xiàn)VHL蛋白及其mRNA失表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[10],VHL的降低產(chǎn)生過量HIF-1a的靶基因VEGF基因，促進(jìn)腫瘤淋巴管的生成。本研究顯示，VHL是LVD表達(dá)高的大腸癌組織平均值比LVD表達(dá)低的大腸癌組織平均值下調(diào)5倍以上基因之一。如果能夠研究出一種新型抗腫瘤藥物，特異性抑制腫瘤組織中VEGFA等促進(jìn)淋巴管生成的基因表達(dá)，或特異性促進(jìn)VHL等抑制淋巴管生成的基因表達(dá)，將為大腸癌的治療開辟一條新的途徑。因此，在基因或蛋白水平抑制某些基因的上調(diào)（如抑制VEGFA作用的環(huán)節(jié)）或下調(diào)（如增強(qiáng)VHL作用的環(huán)節(jié)），將有望在大腸癌的治療道路上取得突破。

由于失訪率較高，60例大腸癌患者預(yù)后及隨訪情況難以得到統(tǒng)計(jì)和分析。由于腫瘤部位所包含的細(xì)胞類型的多樣性，使得人們?cè)诮忉屵@些相關(guān)基因的表達(dá)變化與腫瘤中特定細(xì)胞類型的表型變化相關(guān)性時(shí)遇到一定的困難。本研究按照相關(guān)的功能挑選了部分基因，可以發(fā)現(xiàn)一些與腫瘤相關(guān)的基因表達(dá)變化。特別在原癌基因方面，不同LVD標(biāo)本有不同的表達(dá)，可能與不同原癌基因在不同腫瘤發(fā)生中的作用不同有關(guān)?？梢灶A(yù)測(cè)，大量基因芯片的檢測(cè)結(jié)果對(duì)于大腸癌淋巴管生成調(diào)控基因的研究會(huì)有重要意義。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中LVD隨著原發(fā)腫瘤分化程度減低、浸潤(rùn)加深以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而增高；高LVD的大腸癌組織與低LVD的大腸癌組織間存在差異表達(dá)的基因。

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